肝癌超抗原免疫基因治疗剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种涉及基因工程技术的肝细胞癌（肝癌）超抗原免疫基因治疗剂，其特征是：制备肝癌细胞特异性调控序列介导的超抗原分子和共刺激分子在肝癌细胞进行靶向表达的治疗剂，特异性增强癌细胞的免疫原性和与免疫效应细胞的识别作用。在体内，通过介入方式送到癌区，有效杀伤癌细胞，并可利用相关药物调控该特异性调控序列的活性来调节上述两种分子的表达，并通过该特异性调控序列调控的自身产物水平判断疗效。同时，在体外诱导自身Ｔ细胞进行过继免疫治疗，辅助体内治疗，以增强疗效、治疗转移灶和预防复发。本治疗剂具有安全、靶向、可控和灭癌高效等特点，是一种很有前景的肝癌免疫基因治疗剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术，特别涉及一种肝癌超抗原免疫基因治疗剂。为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是从甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌细胞中分离细胞基因组总DNA，设计特异性引物，通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列；分别从肠葡萄球菌场毒素A标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列，定点突变葡萄球菌场毒素A(SEA)基因位点，同时从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列(B7.1exc)和跨膜区序列(B7.1tm)；将上述片段克隆至载体pLXSN(Clontech公司产品，属逆转录病毒真核表达载体，非本研究专用载体)中，分别构建以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录真核表达载体；将目的基因逆转录病毒载体在病毒包装细胞系PA317、φ2中进行包装；以包装好的缺陷病毒颗粒感染人肝癌细胞，表达出SEA-B7.1融合蛋白；以视黄素、地塞米松、雌激素等药物对SEA-B7.1的表达进行调控，同时通过检测AFP水平来判断治疗效果。利用AFP特异性调控序列调控目的基因B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm的表达，通过设计特异性引物5’CGCAACTTAGGGACAAGT3’CGGAAAATCATGCTGAAA和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG3’GGAGACCAGTTAGG AAGT，通过PCR方法扩增AFP启动子和顺式增强子序列，其序列如下AFP启动子序列GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAAAGGTTACTAGTTAACAGGCATTGCCTGAAAAGAGTATAAAAGAATTTCAGCATGATTTTCCAFP增强子序列GCTGGCTTCACAGACTTATGAAAAAGTAAACGGAATCAGAATTACATCAATGCAAAAGCATTGCTGTGAACTCTGTACTTAGGACTAAACTTTGAGCAATAACACATATAGATTGAGGATTGTTTGCTGTTAGTATACAAACTCTGGTTCAAAGCTCCTCTTTATTGCTTGTCTTGGAAAATTTGCTGTTCTTCATGGTTTCTCTTTTCACTGCTATCTATTTTTCTCAACCACTCACATGGCTACAATAACTGTCTGCAAGCTTATGATTCCCAAATATCTATCTCTAGCCTCAATCTTGTTCCAGAAGATAAAAAGTAGTATTCAAATGCACATCAACGTCTCCACTTGGAGGGCTTAAAGACGTTTCAACATACAAACCGGGGAGTTTTGCCTGGAATGTTTCCTAAAATGTGTCCTGTAGCACATAGGGTCCTCTTGTTCCTTAAAATCTAATTACTTTTAGCCCAGTGCTCATCCCACCTATGGGGAGATGAGAGTGAAAAGGGAGCCTGATTAATAATTACACTAAGTCAATAGGCATAGAGCCAGGACTGTTTGGGTAAACTGGTCACTTTATCTTAAACTAAATATATCCAAAACTGAACATGTACTTAGTTACTAAGTCTTTGACTTTATCTCATTCATACCACTCAGCTTTATCCAGGCCACTTATTTGACAGTATTATTGCGAAAACTTCCTAACTGGTCTCC，其特点是将所获得的调控序列置于目的基因上游，特异性调控目的基因的表达。在肝癌细胞特异性表达超抗原分子SEA和共刺激分子B7.1；设计特殊引物，分别从肠葡萄球菌场毒素A标准菌株FRI100基因组中通过PCR扩增SEA基因全序列和蛋白编码序列，扩增引物分别为5’ATGAAAAAAACAGCATTTAC3’ACTTGTAYTATAAATAT和5’AGCGAGAAAAGCGAAGAA3’ACTTGTATATA AATATAT，以单点或组合的突变方式，定点突变葡萄球菌场毒素A(SEA)基因位点(H81、H187、H225、D227)，设计特殊引物(5’ATGGGCCACACACGGAGGC3’TCCACTACCGTTATCAGGAAAATGCTCTTGC和5’(1)GGTGGCTCTGGCGGTGGC GGATCGGATAACCTGCTCCCATCC(2)GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT3’TTATACAGGGCGTACACT)从人B细胞通过反转录PCR分别扩增共刺激分子B7.1基因编码胞外区序列(B7.1exc)和跨膜区序列(B7.1tm)；分别构建获得B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm融合目的基因；构建以AFP启动子和增强子为调控元件的B7.1exc-SEA-B7.1tm和SEA-B7.1tm目的基因逆转录真核表达载体。本专利技术通过基因工程和细胞生物学手段在肝癌细胞表面建立甲胎蛋白(AFP，alpha-Fetoprotein)增强子和启动子特异性调控的利用超抗原分子葡萄球菌肠毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA)和共刺激分子B7.1双信号免疫激活系统，使肝癌细胞特异性表达强抗原信号SEA的同时，赋予抗原信号共刺激分子B7.1，通过介入方式导入癌区。采用本专利技术可有效提高肝癌细胞诱导免疫排斥反应的能力；同时利用体外经60Co照射的转染SEA-B7.1的AFP高表达肝癌细胞诱导自身T淋巴细胞进行过继免疫治疗，辅助癌区免疫治疗，以增强疗效、治疗转移病灶和预防复发，以达到理想的治疗目的。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明。依照本专利技术的技术方案，从甲胎蛋白(AFP)高分泌的肝癌细胞中分离细胞基因组总DNA，设计特异性引物5’GCAACTTAGGGACAAGT 3’GGAAAATCATGCTGA AA和5’GCTGGCTTCACAGACTTATG 3’GGAGACCAGTTAGGAAGT，通过PCR扩增反应，分别获得AFP启动子和顺式增强子序列，其序列如下AFP启动子序列GCAACTTAGGGACAAGTCATCTCTTTGAATATTCTGTAGTTTGAGGAGAATATTTGTTATATTTGCAAAATAAAATAAGTTTGCAAGTTTTTTTTTTCTGCCCCAAAGAGCTCTGTGTCCTTGAACATAAAATACAAATAACCGCTATGCTGTTAATTATTGGCAAATGTCCCATTTTCAACCTAAGGAAATACCATAAAGTAACAGATATACCAACAAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
肝癌超抗原免疫基因治疗剂，其特征在于：从甲胎蛋白（ＡＦＰ）高分泌的肝癌细胞中分离细胞基因组总ＤＮＡ，设计特异性引物，通过ＰＣＲ方法扩增ＡＦＰ启动子和顺式增强子序列；分别从肠葡萄球菌场毒素Ａ标准菌株ＦＲＩ１００基因组中通过ＰＣＲ扩增ＳＥＡ基因全序列和蛋白编码序列，定点突变葡萄球菌场毒素Ａ（ＳＥＡ）基因位点，同时从人Ｂ细胞通过反转录ＰＣＲ分别扩增共刺激分子Ｂ７．１基因编码胞外区序列（Ｂ７．１ｅｘｃ）和跨膜区序列（Ｂ７．１ｔｍ）；将上述片段克隆至载体ｐＬＸＳＮ中，分别构建以ＡＦＰ启动子和增强子为调控元件的Ｂ７．１ｅｘｃ－ＳＥＡ－Ｂ７．１ｔｍ和ＳＥＡ－Ｂ７．１ｔｍ目的基因逆转录真核表达载体；将目的基因逆转录病毒载体在病毒包装细胞系ＰＡ３１７、φ２中进行包装；以包装好的缺陷病毒颗粒感染人肝癌细胞，表达出ＳＥＡ－Ｂ７．１融合蛋白；以视黄素、地塞米松、雌激素等药物对ＳＥＡ－Ｂ７．１的表达进行调控，同时通过检测ＡＦＰ水平来判断治疗效果； 利用ＡＦＰ特异性调控序列调控目的基因Ｂ７．１ｅｘｃ－ＳＥＡ－Ｂ７．１ｔｍ和ＳＥＡ－Ｂ７．１ｔｍ的表达，通过设计特异性引物：５’ ＣＧＣＡＡＣＴＴＡＧＧＧＡＣＡＡＧＴ ３’ ＣＧＧＡＡＡＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＡＡ和５’ ＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＴＧ ３’ ＧＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＡＧＧ ＡＡＧＴ，通过ＰＣＲ方法扩增ＡＦＰ启动子和顺式增强子序列，其序列如下： ＡＦＰ启动子序列 ＧＣＡＡＣＴＴＡＧＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＡＡＴＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＴ ＡＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＴＧＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＣ ＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡＣＡＴＡＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＡＡＣＣＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＡ ＡＴＴＡＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧ ＡＴＡＴＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＧＧＴＴＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＡＧＧＣＡＴＴＧＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＡ ＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＴＴＴＣＣ ＡＦＰ增强子序列 ＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＴ ＧＣＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＴＴＡＧＧＡＣＴＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡ ＣＡ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：隋延仿，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]