单克隆抗体MERS‑4及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种单克隆抗体MERS‑4及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的抗体，命名为单克隆抗体MERS‑4，由A链和B链组成；A链为（a）或（b）：（a）由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；B链为（c）或（d）：（c）由序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。本发明专利技术提供的单克隆抗体能够有效抑制MERS‑CoV入侵细胞，可作为MERS‑CoV的预防药物或治疗药物，对于MERS‑CoV的预防和治疗具有重要的理论指导价值和广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
单克隆抗体MERS-4及其编码基因和应用
本专利技术涉及一种单克隆抗体MERS-4及其编码基因和应用。
技术介绍
新型冠状病毒（MERS-CoV）于2012年首次在中东地区被发现感染人类，随后这种病毒感染引起的疾病又先后出现在欧洲几个国家和地区。超过半数的感染病人均会出现严重的呼吸道疾病，其临床症状同2003年爆发的由SARS-CoV的临床症状非常相似。由于这种疾病可以人传染给人，引起了全世界的高度关注。到目前为止，还没有特异性的药物和疫苗对这种疾病进行治疗和预防。MERS-CoV利用其表面的膜蛋白（S蛋白）进入易感细胞。S蛋白由位于N端的S1结构域和位于近膜端的S2结构域和跨膜结构域组成，其中病毒对细胞易感性是由S1结构域决定的。通过利用MERS-CoV的S1结构域进行共纯化实验，2013年初Raj的研究小组确定了dipeptideylpeptidase4(DPP4，也称为CD26)为MERS-CoV的受体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种单克隆抗体MERS-4及其编码基因和应用。本专利技术提供了一种抗体，命名为单克隆抗体MERS-4，由A链和B链组成；所述A链为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述B链为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。所述A链和所述B链通过二硫键形成单克隆抗体MERS-4。本专利技术还保护一种DNA组合物，由编码所述A链的DNA分子甲和编码所述B链的DNA分子乙组成。所述DNA分子甲可为如下（1）或（2）或（3）的DNA分子：（1）序列表中序列2自5’末端第889-2274位核苷酸所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码所述A链的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述A链的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。所述DNA分子乙为如下（4）或（5）或（6）的DNA分子：（4）序列表中序列4自5’末端第889-1596位核苷酸所示的DNA分子；（5）在严格条件下与（4）限定的DNA序列杂交且编码所述B链的DNA分子；（6）与（4）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述B链的DNA分子。上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。本专利技术还保护一种表达盒组合物，由表达所述DNA分子甲的表达盒甲和表达所述DNA分子乙的表达盒乙组成。所述表达盒甲具体可如序列表的序列2所示。所示表达盒乙具体可如序列表的序列4所示。本专利技术还保护一种质粒组合物，由重组质粒甲和重组质粒乙组成；所述重组质粒甲为含有所述DNA分子甲或所述表达盒甲的重组质粒；所述重组质粒乙为含有所述DNA分子乙或所述表达盒乙的重组质粒。所述重组质粒甲具体可为含有所述表达盒甲的pMD18-T载体。所述重组质粒乙具体可为含有所述表达盒乙的pMD18-T载体。本专利技术还保护将所述重组质粒甲和所述重组质粒乙共转染哺乳动物细胞得到的重组细胞。所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。本专利技术还保护培养所述重组细胞得到的抗体(IgG1抗体）。本专利技术还保护一种药物，其活性成分为所述单克隆抗体MERS-4；所述药物的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）治疗和/或预防MERS-CoV感染；（Ⅱ）抑制MERS-CoV增殖；（Ⅲ）抑制MERS-CoV入侵哺乳动物；（Ⅳ）治疗和/或预防MERS-CoV引起的疾病。所述“抑制MERS-CoV增殖”具体可为抑制MERS-CoV在哺乳动物细胞中的增殖。所述哺乳动物细胞具体可为Huh7细胞。本专利技术还保护所述单克隆抗体MERS-4在制备药物中的应用；所述药物的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）治疗和/或预防MERS-CoV感染；（Ⅱ）抑制MERS-CoV增殖；（Ⅲ）抑制MERS-CoV入侵哺乳动物；（Ⅳ）治疗和/或预防MERS-CoV引起的疾病。所述“抑制MERS-CoV增殖”具体可为抑制MERS-CoV在哺乳动物细胞中的增殖。所述哺乳动物细胞具体可为Huh7细胞。本专利技术提供的单克隆抗体能够有效抑制MERS-CoV入侵易感细胞，可作为MERS-CoV的预防药物或治疗药物，对于MERS-CoV的预防和治疗具有重要的理论指导价值和广泛的应用前景。附图说明图1为MERS-4溶液的SDS-PAGE电泳图。图2为实施例2的步骤一至步骤四的中和活性结果；纵坐标为中和活性（%），横坐标为稀释液中的蛋白浓度以e为底的对数值。图3为实施例2的步骤五的中和活性结果；纵坐标为中和活性（%），横坐标为稀释液中的蛋白浓度以e为底的对数值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。293T细胞（人肾上皮细胞系）：ATCC,CRL-11268TM。Huh7细胞（肝癌细胞系）：JCRB，JCRB0403。TZM-BL细胞(宫颈癌细胞系)：NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram(Cat.No.8129)。pMD18-T载体：Takara。pcDNA3.1(+)载体：Invitrogen公司。骨架质粒pNL4-3R-E-luciferase：参考文献:HeJ,ChoeS,WalkerR,DiMarzioP,MorganDO,LandauNR.JVirol69:6705–6711,1995.。实施例1、单克隆抗体的发现通过序列和模型分析发现MERS-CoV可能有一个潜在的受体结合域(ReceptorBindingDomain,RBD)，将RBD和可溶性DPP4蛋白共结晶，解析蛋白的结构，发现RBD中有与DPP4结合的关键氨基酸位点。利用纯化的RBD进行动物免疫，发现其具有较强的诱导中和抗体产生的能力。利用RBD筛选展示在酵母表面的人类非免疫scFvs文库（scFvs的英文全称为“single-chainvariablefragments”），得到了若干具有中和活性的单克隆抗体。将其中一个单克隆抗体命名为单克隆抗体MERS-4（属于IgG1抗体）。实施例2、单克隆抗体MERS-4的制备1、合成序列表的序列2所示的双链DNA片段甲，然后将DNA片段甲插入pMD18-T载体，得到重组质粒甲。序列表的序列2中，自5’末端第1-888位核苷酸为CMV启动子，第889-2274位核苷酸为单克隆抗体MERS-4的重链的编码基因，第2275-2402为ployA。序列表的序列2所示的双链DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体，由A链和B链组成；所述A链为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；所述B链为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种抗体，由A链和B链组成；所述A链为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述B链为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。2.DNA组合物，由编码权利要求1中的所述A链的DNA分子甲和编码权利要求1中的所述B链的DNA分子乙组成。3.如权利要求2所述的DNA组合物，其特征在于：所述DNA分子甲为序列表中序列2自5’末端第889-2274位核苷酸所示的DNA分子；所述DNA分子乙为序列表中序列4自5’末端第889-1596位核苷酸所示的DNA分子。4.一种表达盒组合物，由表达权利要求2或3中的所述DNA分子甲的表达盒甲和表达权利要求2或3中的所述DNA分子乙的表达盒乙组成。5.一种质粒组合物，由重组质粒甲和重组质粒乙组成；所述重组质粒甲为含有权利要求2或3中的所述DNA分子甲或含有权利要求4中的所述表达盒甲的重组质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张林琦，王新泉，江力玮，王年爽，史宣玲，左腾，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11