一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌及其表达蛋白染色的试剂盒及其方法。本发明专利技术提供了一种染色结核分枝杆菌及其表达蛋白的方法，包括如下步骤：1)对含有结核分枝杆菌的待测样本依次进行一抗孵育和二抗孵育，得到抗体结合产物；2)将所述抗体结合产物依次经DAB染色液染色、石碳酸复红染色液染色和苏木素染色液染色，实现染色结核分枝杆菌及其表达蛋白。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术开发了一种能用于结核病病理学诊断的新试剂盒，该试剂盒可以实现在一张组织标本切片中同时检测结核分枝杆菌菌体及其表达的蛋白，从而提高结核病病理学诊断敏感性。该试剂盒使用方法简便，适用于病理科开展常规检测，具有良好的临床推广价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试剂盒及其方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试剂盒及其方法。
技术介绍
结核病是严重威胁人类健康的传染性疾病，全球有1/3的人口感染了结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，每年有200万人死于结核病，其死亡率在传染性疾病中仅低于艾滋病排第二。目前结核病诊断的金标准是痰细菌学检测。但是痰涂片阳性率低，痰培养需要一个月的时间才能出结果，因此最常用的痰细菌学检测手段无法满足临床确诊的需求。此外，近年来基于免疫学的ELISPOT以及基于核酸检测的PCR等新技术也应用到了结核病诊断中。但是ELISPOT技术无法分辨潜伏感染者与真正的结核病患者，因此在MTB感染率非常高的中国诊断价值非常有限。而多种PCR技术由于对设备、技术人员的要求高，且测试成本高等原因无法普及到各级医疗机构。病理学诊断是结核病确诊的重要途径，尤其是对于痰细菌学阴性的结核病患者及肺外结核患者的诊断。结核病组织病理学特征是肉芽肿性炎症，病变内可见类上皮细胞、朗汉斯巨细胞以及干酪样坏死等。由于其他感染性或非感染性疾病也可能会出现类似病理变化，临床上确诊结核病还需要在组织标本中检测到MTB的存在。目前使用最广泛的MTB检测方法是萋尼氏(Ziehl-Neelsen)染色法，但存在敏感性低，寻找MTB费时费力等缺点。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法。本专利技术提供的用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法，包括如下步骤：1)将待检测组织切片与抗MTB抗原抗体溶液反应，得到一抗结合切片；2)将所述一抗结合切片与二抗溶液反应，得到二抗结合切片；3)用DAB染色液对所述二抗结合切片进行染色，得到DAB染色切片；4)用石碳酸复红染色液对所述DAB染色切片染色，得到石碳酸复红染色切片；5)用苏木素染色液对所述石碳酸复红染色切片染色，得到染色切片，实现组织切片染色。上述方法中，所述抗MTB抗原抗体为抗MTB抗原多克隆抗体；所述MTB抗原的氨基酸序列为序列表中序列1；所述二抗溶液的二抗为羊抗兔IgG抗体；所述羊抗兔IgG抗体具体HRP标记的羊抗兔IgG抗体。二抗溶液采用羊抗兔-HRP二抗，迈新生物的产品。上述方法中，步骤1)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为0.5-2h；步骤2)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为10-20min。步骤3)中，所述染色时间为1-10min、染色温度为23-28℃；步骤4)中，所述染色时间为20-90min、染色温度为23-28℃；步骤5)中，所述染色时间为0.5-2min、染色温度为23-28℃。上述方法中，在步骤1)-2)之间，还包括如下步骤：洗涤所述一抗结合切片；在步骤2)-3)之间，还包括如下步骤：洗涤所述二抗结合切片；在步骤3)-4)之间，还包括如下步骤：洗涤所述DAB染色切片；在步骤4)-5)之间，还包括如下步骤：先用分化液脱色所述石碳酸复红染色切片得到脱色后石碳酸复红染色切片，再洗涤所述脱色后石碳酸复红染色切片；所述洗涤采用的洗涤液具体浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS或水；在步骤5)中，在所述染色得到染色切片后还包括如下步骤：先分化液脱色所述染色切片，得到脱色后染色切片，再洗涤所述脱色后染色切片；所述洗涤采用的洗涤液具体浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS或水。上述方法中，所述脱色时间均为30秒-60秒。上述方法中，所述待检测组织切片为石蜡包埋的待检测组织切片。上述方法中，在所述方法的步骤1)前，还包括如下步骤：A、将所述石蜡包埋的待检测组织切片进行脱蜡水化，得到脱蜡水化后切片；B、将所述脱蜡水化后切片在浓度为0.01M、pH值为6.0的柠檬酸缓冲液中高压修复，得到修复后切片；所述高压的压力为80-100千帕；所述修复时间为90s，所述修复的温度为100℃；本专利技术的另一个目的是提供一种用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括DAB染色液、石碳酸复红染色液和苏木素染色液。上述试剂盒还包括记载在可读载体上的染色方法，所述染色方法为上述的方法。所述可读载体具体为说明书。上述的试剂盒在如下1)或2)至少一种中的应用也是本专利技术保护的范围：1)制备检测或辅助检测或诊断或辅助诊断结核分枝杆菌产品中的应用；2)制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有结核分枝杆菌产品中的应用。0.01mol/L、pH值为6.0的柠檬酸钠缓冲液:将2.41g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)及0.38g柠檬酸(C6H8O7·H2O)溶于1L蒸馏水中。抗MTB抗原的多克隆抗体溶液：将MTB抗原(氨基酸序列为序列1)免疫新西兰白兔，收集兔血清，利用proteinG纯化获得抗MTB抗原的多克隆抗体溶液。DAB染色液：先配置20×DAB染色母液：将0.1g二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)倒入10ml蒸馏水中，得到混合液，向混合液中加入3-5滴10MHCl至混合液变为浅棕色则DAB溶解完全，分装，保存于-20℃。临用前用0.1MPB缓冲液(29gNa2HPO4·12H2O及3gNaH2PO4·2H2O溶于1L蒸馏水中)将20×DAB染色母液稀释至1×工作液后加入H2O2至终浓度0.03％。；石碳酸复红染色液：先配置10ml碱性复红乙醇饱和液(将1g碱性复红溶于10ml无水乙醇中)和配置90ml5％石碳酸溶液(将5g苯酚溶于蒸馏水)，再将这两种溶液混合即为石炭酸复红液。分化液：在27ml蒸馏水中加入3ml浓盐酸和70ml无水乙醇，混匀即为分化液。苏木素染色液：将5g苏木素溶于50ml无水乙醇，得到苏木素无水乙醇液；再将44g硫酸铝钾放入1L蒸馏水中加热溶解，得到硫酸铝钾溶液；再将苏木素无水乙醇液和硫酸铝钾溶液混合，得到混合液；等混合液沸腾后搅拌冷却至91℃左右，缓慢加入2.5g氧化汞，溶解完毕后置于冷水中冷却，得到反应产物，次日过滤反应产物，收集滤液，再向滤液中加入4g柠檬酸，搅匀即为苏木素染色液。浓度为0.01M、pH值为7.4PBS配方：2.9gNa2HPO4·12H2O,0.3gNaH2PO4·2H2O及9gNaCl溶于1L蒸馏水中，调节pH值为7.4。本专利技术的实验证明，本专利技术开发了一种用于结核分枝杆菌及其抗原双重染色的试剂盒，该试剂盒可以实现在一张组织标本切片中同时检测MTB及其表达的蛋白，从而提高病理学诊断结核病的敏感性。该试剂盒使用方法简便，适用于病理科开展常规检测，具有良好的临床推广价值。附图说明图1为在结核病组织切片中按照4种不同染色方法进行染色的结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、结核病组织标本染色方法一、试剂的配置：0.01mol/L、pH值为6.0的柠檬酸钠缓冲液:将2.41g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)及0.38g柠檬酸(C6H8O7·H2O)溶于1L蒸馏水中。浓度为0.01M、pH值为7.4PBS配方：2.9gNa2HPO4·12H2O,0.3gNaH2P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法，包括如下步骤：1)将待检测组织切片与抗MTB抗原抗体溶液反应，得到一抗结合切片；2)将所述一抗结合切片与二抗溶液反应，得到二抗结合切片；3)用DAB染色液对所述二抗结合切片进行染色，得到DAB染色切片；4)用石碳酸复红染色液对所述DAB染色切片染色，得到石碳酸复红染色切片；5)用苏木素染色液对所述石碳酸复红染色切片染色，得到染色切片，实现组织切片染色。

【技术特征摘要】
1.一种用于结核分枝杆菌检测的组织切片染色方法，包括如下步骤：1)将待检测组织切片与抗MTB抗原抗体溶液反应，得到一抗结合切片；2)将所述一抗结合切片与二抗溶液反应，得到二抗结合切片；3)用DAB染色液对所述二抗结合切片进行染色，得到DAB染色切片；4)用石碳酸复红染色液对所述DAB染色切片染色，得到石碳酸复红染色切片；5)用苏木素染色液对所述石碳酸复红染色切片染色，得到染色切片，实现组织切片染色；所述待检测组织切片为石蜡包埋的待检测组织切片。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗MTB抗原抗体为抗MTB抗原多克隆抗体溶液；所述MTB抗原的氨基酸序列为序列表中序列1；所述二抗为羊抗兔IgG抗体；所述羊抗兔IgG抗体具体HRP标记的羊抗兔IgG抗体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为0.5-2h；步骤2)中，所述反应的温度为23-28℃，所述反应的时间为10-20min；步骤3)中，所述染色时间为1-10min、染色温度为23-28℃；步骤4)中，所述染色时间为20-90min、染色温度为23-28℃；步骤5)中，所述染色时间为0.5-2min、染色温度为23-28℃。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤1)-2)之间，还包括如下步骤：洗涤所述一抗结合切片；所述洗涤采用的洗涤液具体为浓度为0.01M、pH值为7.4的PBS；在步骤2)-3)之间，还包括如下步骤：洗涤所述二抗结合切片；所述洗涤采用的洗涤液具体为浓度为0.01M、pH值...

【专利技术属性】
技术研发人员：车南颖，张海青，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京胸科医院，
类型：发明
国别省市：北京;11