一种鱼类骨骼的染色方法技术

本发明专利技术公开了一种鱼类骨骼的染色方法，包括以下步骤：（1）样品前处理；（2）脱水；（3）软骨染色；（4）中和；（5）漂白；（6）酶解；（7）硬骨染色；（8）保存。该方法稳定性和重复性高；且中采用的设备和材料简单，成本低廉，容易获得，且只需对样品所处条件进行控制即可，不需专人照看，省时省工，可大大降低科研成本，提高人工工作效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼类
，具体涉及一种鱼类骨骼的染色方法。
技术介绍
分析鱼类的骨骼，可以研究其骨骼的发育顺序、发育时间，以及确定鱼类骨骼畸形和进行相关统计。事实上，Micro CT扫描、X光透视等一些利用大型仪器的手段都可以实现对骨骼进行分析，但是由于这些方法一方面存在仪器昂贵的问题，另一方面分辨率达不到分析的要求，因此在鱼类骨骼研究中应用很少。染色方法是一种成本低、容易实现的可对骨骼进行分析的有效途径。经过处理的样品，能有效实现对鱼类骨骼进行观察、分析、绘图及拍照等。一般地，利用阿利新蓝易与软骨结合显蓝色，茜素红与硬骨结合显红色的原理，达到对骨骼进行染色分辨的目的。但是在实验过程中，可能由于不当的操作（时间、温度等的条件控制）会使染色出现异常，如硬骨着蓝色、红色着色不明显等。这种问题的出现，会对研究造成不可猜测的差错。同时，由于一种方法在不同批次上的使用，导致得结果出现反复，失去可重复性，进而造成实验结果缺少说服力。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鱼类骨骼的染色方法，该染色方法可获得稳定性好、重复性高的染色鱼类骨骼，有利于鱼类骨骼发育、骨骼畸形分析等骨学研究。本专利技术的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种鱼类骨骼的染色方法，包括以下步骤：（1）样品前处理，取鱼体样本，浸没在中性福尔马林溶液中，浸泡后冷冻保存；（2）脱水：将冷冻保存后的鱼体样本取出，先后置于不同浓度的乙醇溶液中进行逐步脱水；（3）软骨染色：将脱水处理后的鱼体样本置于阿利新蓝染料中，进行浸泡染色；（4）中和：将浸泡染色后的鱼体样本，先采用中和液清洗至流出液为无色，再将其浸泡于中和液中进行中和处理；（5）漂白：将中和后的鱼体样本置于漂洗液中，漂洗至鱼体样本表面深色色素淡化；（6）酶解：将漂洗过的鱼体样本置于酶解液中进行多次酶解，每次酶解时更换酶解液，酶解至鱼类骨骼脊柱细节清晰；（7）硬骨染色：将酶解过的鱼体样本，置于硬骨染色液中，进行硬骨染色处理；（8）保存：将硬骨染色处理后的鱼体样本置于甘油中进行保存，获得染色完成的鱼类骨骼。在上述鱼类骨骼的染色方法中：步骤（1）中所述的中性福尔马林溶液由福尔马林、去离子水、NaH2PO4·H2O和Na2HPO4-制成，其中福尔马林、去离子水、NaH2PO4·H2O和Na2HPO4的用量关系为200mL：1800mL：8g：13g，其中所述的中性福尔马林溶液的体积百分含量为10%。步骤（1）中浸泡至少24h后重新更换中性福尔马林溶液在0~8℃冷冻保存至少一周，其中冷冻保存时鱼体样本与中性福尔马林溶液的用量关系为1g：200~250mL。在进行染色操作前，鱼类样本需要放置在上述中性福尔马林溶液中至少一周。步骤（2）中先后置于不同浓度的乙醇溶液中进行逐步脱水时，至少脱水4次，首先置于体积百分含量为70~75%的乙醇溶液中，脱水至少24h，接着置于体积百分含量为80~85%的乙醇溶液中，脱水至少24h，再置于体积百分含量为90~95%的乙醇溶液中，脱水至少24h，最后置于无水乙醇中，脱水至少24h，其中鱼体样本与乙醇溶液或无水乙醇的用量关系为1g：10~50mL。本专利技术采用梯度乙醇溶液浸泡，对鱼体样本的彻底脱水有积极作用。步骤（3）中鱼体样本与阿利新蓝染料的用量关系为1g：10~20mL，浸泡染色时间为15~18h，其中阿利新蓝染料由无水乙醇、醋酸和阿利新蓝组成，三者的用量关系为1.3~1.5mL：2~3.5mL：1mg。步骤（4）中所述的中和液为饱和硼砂溶液。 中和液是由过量的硼砂（四硼酸钠）溶于蒸馏水配制而成的一种过饱和溶液。本专利技术中的饱和硼砂溶液配制过程优选如下：将硼砂加入去离子水中，用磁力搅拌器持续进行搅拌，直至最终饱和（有硼砂固体无法完全溶解），静置取上层清液使用。本专利技术中的硼砂溶液的配制温度和使用温度不宜相差过大，因为其在水中的溶解性大，因而温度会较大影响硼砂的溶解度。对鱼体样本进行浸泡中和之前，先对鱼体样本采用中和液进行冲洗，以缩短鱼体样本浸泡中的时间。步骤（5）中漂洗采用过氧化氢水溶液，其体积百分含量为0.4~0.45%。本专利技术漂洗的具体过程优选为：将鱼体样本置于漂洗液中，不断进行搅拌，使粘附在鱼体样本表面的气泡迅速释放离开样品表面，漂洗至样品表面深色色素淡化，但又不宜过长时间漂洗，否则样品体腔内可能会因为积攒气体而膨大，而对后续的处理产生不利影响。在样品体腔未充气前提下，淡化至表面色素淡化，鱼体透明可见肌肉即可。步骤（6）中酶解液为胰蛋白酶溶液，酶解温度为30~37℃，鱼体样本与酶解液的用量关系为1g：200~300mL，所述的酶解液由胰蛋白酶、饱和硼砂溶液和EDTA组成，三者的用量关系为9g：8000~9000mL：0.9~1g；开始每隔3~5h更换一次酶解液，至酶解液颜色没有显著蓝色后，每天更换一次酶解液。酶解过程中，随时镜检样品，如样品透明，脊柱细节清晰呈现，即可定义为酶解结束。酶解过程中，每天都需要对样品进行镜检，以判断酶解进程（是否结束）。整个酶解过程可以放置在约37℃的恒温环境中进行。酶解过程中，EDTA的加入具有促进胰蛋白酶的作用。EDTA对游离的二价离子具有螯合作用，可以减少金属离子对胰蛋白酶的抑制，对酶解液体系的稳定具有促进作用。步骤（7）中硬骨染色液为茜素红的氢氧化钾溶液，其通过将茜素红加入氢氧化钾溶液中制成，其中茜素红与氢氧化钾水溶液的用量关系为0.05~0.15g:1L，氢氧化钾水溶液中氢氧化钾的质量百分含量为0.8~1%。硬骨染色液最好新鲜配制并使用。步骤（8）中鱼体样本与甘油水溶液的用量关系为：1g：200~300mL，甘油水溶液中甘油的质量百分含量为10~30%，保存温度为0~8℃。甘油使用前最好经过灭菌处理。本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术通过对各步骤的工艺条件进行优化，组合，能消除实验误差；（2）本专利技术方法稳定性和重复性高；（3）本专利技术方法中采用的设备和材料简单，成本低廉，容易获得，且只需对样品所处条件进行控制即可，不需专人照看，省时省工，可大大降低科研成本，提高人工工作效率。附图说明图1是本专利技术实施例1中的鱼类骨骼的染色方法的框图；图2是本专利技术实施例1中的鱼体样本中已骨化的骨骼的染色效果图；图3是本专利技术实施例1中的鱼体样本中已骨化的和未骨化的骨骼的染色效果图；图4是本专利技术实施例1中的鱼体样本中已骨化的、未完全骨化的和脊椎错位的骨骼的染色效果图；其中1指已骨化的骨骼，2指未骨化的骨骼，3指未完全骨化的骨骼，4指脊椎错位的骨骼（一种脊柱畸形）。具体实施方式实施例1本实施例提供的鱼类骨骼的染色方法，如图1中所示，包括以下步骤：S1．样品前处理：新鲜采集的鱼体样品，需要浸没放置在10%中性福尔马林中，24 h后更换保存液，转移至4℃中进行保存；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类骨骼的染色方法，其特征是包括以下步骤：（1）样品前处理，取鱼体样本，浸没在中性福尔马林溶液中，浸泡后冷冻保存；（2）脱水：将冷冻保存后的鱼体样本取出，先后置于不同浓度的乙醇溶液中进行逐步脱水；（3）软骨染色：将脱水处理后的鱼体样本置于阿利新蓝染料中，进行浸泡染色；（4）中和：将浸泡染色后的鱼体样本，先采用中和液清洗至流出液为无色，再将其浸泡于中和液中进行中和处理；（5）漂白：将中和后的鱼体样本置于漂洗液中，漂洗至鱼体样本表面深色色素淡化；（6）酶解：将漂洗过的鱼体样本置于酶解液中进行多次酶解，每次酶解时更换酶解液，酶解至鱼类骨骼脊柱细节清晰；（7）硬骨染色：将酶解过的鱼体样本，置于硬骨染色液中，进行硬骨染色处理；（8）保存：将硬骨染色处理后的鱼体样本置于甘油中进行保存，获得染色完成的鱼类骨骼。

【技术特征摘要】
1.一种鱼类骨骼的染色方法，其特征是包括以下步骤：
（1）样品前处理，取鱼体样本，浸没在中性福尔马林溶液中，浸泡后冷冻保存；
（2）脱水：将冷冻保存后的鱼体样本取出，先后置于不同浓度的乙醇溶液中进行逐步脱水；
（3）软骨染色：将脱水处理后的鱼体样本置于阿利新蓝染料中，进行浸泡染色；
（4）中和：将浸泡染色后的鱼体样本，先采用中和液清洗至流出液为无色，再将其浸泡于中和液中进行中和处理；
（5）漂白：将中和后的鱼体样本置于漂洗液中，漂洗至鱼体样本表面深色色素淡化；
（6）酶解：将漂洗过的鱼体样本置于酶解液中进行多次酶解，每次酶解时更换酶解液，酶解至鱼类骨骼脊柱细节清晰；
（7）硬骨染色：将酶解过的鱼体样本，置于硬骨染色液中，进行硬骨染色处理；
（8）保存：将硬骨染色处理后的鱼体样本置于甘油中进行保存，获得染色完成的鱼类骨骼。
2.根据权利要求1所述的鱼类骨骼的染色方法，其特征是：步骤（1）中所述的中性福尔马林溶液由福尔马林、去离子水、NaH2PO4·H2O和Na2HPO4-制成，其中福尔马林、去离子水、NaH2PO4·H2O和Na2HPO4的用量关系为200mL：1800mL：8g：13g，其中所述的中性福尔马林溶液的体积百分含量为10%。
3.根据权利要求1所述的鱼类骨骼的染色方法，其特征是：步骤（1）中浸泡至少24h后重新更换中性福尔马林溶液在0~8℃冷冻保存至少一周，其中冷冻保存时鱼体样本与中性福尔马林溶液的用量关系为1g：200~250mL。
4.根据权利要求1所述的鱼类骨骼的染色方法，其特征是：步骤（2）中先后置于不同浓度的乙醇溶液中进行逐步脱水时，至少脱水4次，首先置于体积百分含量为70~75%的乙醇溶液中，脱水至少24h，接着置于体积百分含量为8...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑攀龙，马振华，江世贵，何丹，张楠，傅明俊，张殿昌，杨丽诗，黄建华，周发林，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44