一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子诊断领域，提供了一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含能分别扩增出含TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664的片段的引物对和对扩增产物测序所用的测序引物。本发明专利技术还提供了使用该试剂盒非诊断检测TERT基因组合突变位点的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒 专利
本专利技术涉及分子诊断领域，具体的说，本专利技术涉及检测TERT基因组合突变位点的 试剂盒。
技术介绍
人端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，由人端粒酶逆转录酶（hTERT)、人端粒酶 RNA组分（hTR)以及人端粒酶相关蛋白（hTEPl等）组成。端粒酶以hTERC为模板，在 hTERT催化作用下逆转录合成端粒DNA。近年来多项研究发现，编码端粒酶复合体的相关 基因突变，使端粒酶功能障碍、端粒缩短，细胞衰老、基因组不稳定性增加，进而出现骨髓 衰竭综合征，如Neal S. Young对124例获得性再障骨髓衰竭综合征患者的TERT基因的 16个外显子进行了筛查，在7例患者中发现5个TERT突变（Blood2003 ;102:916-918)，而 Juan Liang在日本的儿童获得性再障骨髓衰竭综合征患者中发现了 2个新的TERT突变 (Hematologica2006 ;91:656-658)，此外TERT的突变对骨髓衰竭综合征患者治疗效果有一 定影响（Bl〇〇d2011117 (21):5607-11和中国博士论文全文数据库：中国北方骨髓衰竭综合 征端粒酶基因突变和专利长度变化的研究刘博中国协和医科大学)。因此，检测TERT突变 位点对骨髓衰竭综合征的筛查、指导临床治疗、科学研究有着重要的意义。 检测多态性位点处的突变可以使用PCR+RFLP法，这种检测方法针对检测位点选 择特异性的限制性内切酶进行酶切，然后对酶切产物电泳，通过是否被限制性内切酶切开 而判断是否存在突变位点。这种方法的最大缺点是必须有可以特异性识别突变位点的限制 性内切酶，且其他位点最好不能有被该限制性内切酶识别的序列，否则可能造成结果判断 复杂。 PCR+测序的方法能直接得到多态性位点及其邻近序列的核酸序列，操作简单(测 序可交由测序公司完成)，结果可靠(可以通过邻近序列判断是否特异性扩增出了所需片 段)。但同时检测多个多态性位点时，针对每个位点的引物所用PCR反应条件不同，每份样 品的每个位点都要单独设置反应条件，造成工作量/仪器/时间的较大浪费。
技术实现思路
针对上述问题，专利技术人分析了 TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、 RS121918661、RS121918662、RS121918663 和 RS121918664 及其邻近序列，设计了 大量引 物，经过对每对引物反应条件的优化和比较，从中筛选到了特异性强、灵敏度高、且PCR反 应条件近似的5对引物，组成了本专利技术的试剂盒。该试剂盒一次扩增过程可以同时检测血 液、组织、细胞等多种样本中6个TERT位点的突变情况。为了确保检测的准确性，专利技术人还 在试剂盒中加入了突变的阴性质控品与阳性质控品，在检测样本时同时检测两种质控品， 以监控检测过程的有效性。本专利技术还在此基础上提供了非诊断检测TERT基因多态性位点 RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664 突变的 方法。 -方面，本专利技术提供了一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含 引物对，所述引物对能扩增出含选自TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、 RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664 中的一个或多个位点的片段。 进一步的，该试剂盒包含扩增RS34094720的引物对F1/R1、扩增RS61748181和 RS121918661的引物对F2/R2、扩增RS121918662的引物对F3/R3、扩增RS121918663的引物 对F4/R4、以及扩增RS121918664的引物对F5/R5, 5对引物序列分别为： Fl :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1); Rl :5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO :2); F2 :5,-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO :3); R2 :5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO :4); F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5); R3 :5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO :6); F4 :5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7); R4 :5'-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3'（SEQ ID NO :8); F5 :5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO :9); R5 :5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO :10)。 进一步的，该试剂盒还包括5条测序引物，其序列分别为： RS34094720 的测序引物 Fl :5' -CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1); RS61748181 和 RS121918661 的测序引物 F2 :5' -AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO ：3)； RS121918662 的测序引物 F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5) RS121918663 的测序引物 F4 :5' -CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7); RS121918664 的测序引物 R5 :5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO :10)。 进一步的，试剂盒中的5对引物PCR扩增时的反应条件同为： 94°C 3 分钟，1 个循环；94°C 30 秒，63°C 30 秒，72°C 50 秒，30 个循环；72°C 5 分钟， 1个循环。 进一步的，还包括了阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品由包含有上述5个位 点的突变序列的质粒组成。阴性质控品由包含有上述5个位点的非突变序列的质粒组成。 另一方面，本专利技术提供了非诊断检测选自TERT基因多态性位点RS34094720、 RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663 和 RS121918664 中的一个或多个位 点的突变的方法，步骤包括提取基因组DNA、使用引物对PCR扩增出包含位点的片段、对扩 增产物测序。 其中非诊断检测方法可以是用于科研用途的方法，例如可以非诊断的检测来自各 保藏机构的细胞株样本，或者医疗机构所收集的研究用细胞/血液样本，这些样本的样本 主体已经去世/治愈/去向不明，所以显然检测其突变并不是为了检测样本主体的健康状 态而是为了科研。 进一步的，该方法使用上述引物Fl/Rl、F2/R2、F3/R3、F4/R4和F5/R5在相同PCR 条本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含引物对，所述引物对能扩增出含选自TERT基因多态性位点RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、RS121918663、RS121918664中的一个或多个位点的片段。

【技术特征摘要】
1. 一种TERT基因组合突变位点的检测试剂盒，其包含引物对，所述引物对能扩增 出含选自 TERT 基因多态性位点 RS34094720、RS61748181、RS121918661、RS121918662、 RS121918663、RS121918664中的一个或多个位点的片段。2. 权利要求1所述的试剂盒，其包含扩增RS34094720的引物对F1/R1、扩增 RS61748181 和 RS121918661 的引物对 F2/R2、扩增 RS121918662 的引物对 F3/R3、扩增 RS121918663的引物对F4/R4、以及扩增RS121918664的引物对F5/R5,5对引物序列分别 为： FI :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1); R1 :5'-CCGCACGCTCATCTTCCAC-3'（SEQ ID NO :2); F2 :5'-AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO :3); R2 :5'-AAGTGCTTGGTCTCGGCGTA-3'（SEQ ID NO :4); F3 :5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID NO :5); R3 :5'-AGCCGTTGCGGTTCCTTCT-3'（SEQ ID NO :6); F4 :5'-CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7); R4 :5,-CGAGCAAGTGCTAACAGGCAT-3，（SEQ ID NO :8); F5 :5'-CTGTGCCACCAAGCATTCC-3'（SEQ ID NO :9); R5:5'-GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID N0:10)。3. 权利要求2所述的试剂盒，还包括5条测序引物，其序列分别为： RS34094720 的测序引物 FI :5'-CGGCCCTCCTTCCTACTCAG-3'（SEQ ID NO :1); RS61748181 和 RS121918661 的测序引物 F2 :5' -AACACGGTGACCGACGCA-3'（SEQ ID NO : 3)； RS121918662 的测序引物 F3:5'-TGTTCAGCGTGCTCAACTACGA-3'（SEQ ID N0:5) RS121918663 的测序引物 F4 :5' -CGTCCTGATCGGAAGAAACAAG-3'（SEQ ID NO :7); RS121918664 的测序引物 R5 :5' -GGATGGTCTTGAAGTCTGAGGG-3'（SEQ ID NO :10)。4. 权利要求2所述的试剂盒，其特征在于试剂盒中的5对引物PCR扩增时...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤郡，陈颖，陈南，何娟，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44