一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法技术

本发明专利技术公开了一组PCR鉴别引物，该组引物由三条引物组成，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还提供以前述引物组鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用前述引物组对其进行PCR扩增；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测。在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。本发明专利技术提供的方法能快速、准确鉴定白及的原植物、饮片药材和粉末药材，又能同步鉴别黄花白及的原植物、饮片药材和粉末药材，并能实现与其他植物的鉴别。

【技术实现步骤摘要】
一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法
本专利技术涉及分子标记
，特别是涉及一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法。
技术介绍
中药白及具有收敛止血、消肿生肌的功效，可用于咳血吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂的治疗。历版中国药典收载均为兰科白及属植物白及BletillastriataRchb.f.，同时，白及作为珍稀濒危植物，野生资源匮乏，而栽培资源尚难以满足市场需求，使药材价格逐年上涨。但由于该物种的分布具有地域性，一些地区性的中药材标准以黄花白及B.ochraceaSchltr.植物作为白及的替代药用品种(《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003年版)，《四川省中药材标准》(2010年版))，但作为地区性品种其资源使用受到一定局限。专利技术人在对白及药材市场进行实地走访和调查发现，以黄花白及的块茎冠以正品白及药材出售的现象极为普遍，而且以同属、同科植物块茎作为白及药材混淆使用的现象也屡见不鲜。由于白及和黄花白及在非花期植物形态很难准确分辨，而且这2种物种的块茎在表观性状、组织构造、理化成分上也极为相似，当块茎被加工为饮片、粉末时鉴别难度就更大，既便是有丰富鉴定学知识和鉴别经验者也会筹措难定。白及B.striataRchb.f.是国家药典明确规定的中药白及品种，黄花白及的经济、药用价值与白及尚有一定差距。目前，运用DNA分子标记技术对白及属植物进行鉴定上，有学者运用过SCAR分子标记方法对黄花白及B.ochraceaSchltr.与白及B.striataRchb.f.、小白及B.formosanaSchltr.和云南独蒜兰(又名独叶白芨)Pleioneyunnnanensis(Rolfe)Rolfe进行鉴定区别(赵爽，黄春球，杨耀文，等.黄花白及的SCAR分子标记转化研究.中草药，2012，43(10):2036-2039)，也有学者采用SRAP标记技术，拟探索建立一个分析白及物种遗传多样性的实验体系(蒋瑞彬，徐旭栋，蓝小明，等.野生白及SRAP-PCR反应体系的优化，中华中医药学刊，2013，31(2):353-355)，但以白及B.striataRchb.f.为研究对象，将之与黄花白及和其他植物进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。本专利技术提供的一组PCR鉴别引物及以之鉴别白及、黄花白及的方法，只需在一个扩增体系内进行PCR扩增反应，即能快速、准确鉴定白及的原植物、饮片药材和粉末药材，又能同步鉴别黄花白及的原植物、饮片药材和粉末药材，并能实现白及和黄花白及与其他植物的鉴别。在提交本专利技术申请之前，尚无任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR鉴别引物组及同步鉴别白及、黄花白及的分子鉴定方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一组PCR鉴别引物。本专利技术的另外一个目的在于提供上述鉴别引物组在白及、黄花白及鉴定中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一组PCR鉴别引物，其核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。前述的PCR鉴别引物组在白及、黄花白及鉴别中的应用。包括前述引物的试剂盒。一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的基因组DNA；2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，使用前述引物组对其进行PCR扩增；3)对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测。在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。具体的说，所述的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，优选的，所述的PCR扩增反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液6～8μL，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3各2～5pmol，模板DNA20～160ng，ddH2O补足25μL。所述的PCR反应程序为95℃预变性1～5min，25～40个循环(95℃变性1～20s、52～68℃退火延伸1～30s)。更优选的，所述的PCR反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液7μL，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3各4pmol，模板DNA40ng，ddH2O补足25μL。所述的PCR反应程序为95℃预变性1min，30个循环(95℃变性2s、66℃退火延伸5s)。一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法，所述的步骤3)，其特征在于对步骤2)的PCR扩增产物进行电泳检测，在354bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为白及，在519bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为黄花白及，在354bp和519bp处均未检测出条带的待鉴定样品鉴定为其他植物材料。专利技术人进行了一系列实验，以优选本专利技术提供的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及的方法的PCR扩增条件等，证明本专利技术鉴定方法的有效性。具体技术方案如下：一、引物设计在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI，美国国立生物技术信息中心)下载到白及与其近缘物种的核糖体基因序列和叶绿体基因序列，共246条。另选用通用引物对白及与其近缘物种进行扩增并测序，成功获取50条rDNA-ITS序列和15条psbA-trnH序列。运用ClustalX2.1软件对以上序列进行排序、比对、分析，找出白及、黄花白及的特异性位点，针对此位点设计一组特异性鉴别白及和黄花白及的PCR引物，该组引物由3条引物组成，其核酸序列分别如下：SEQIDNO.1：5'—GCCCAGAACAGCCATCCAAGT—3'SEQIDNO.2：5'—TTGGCACGGAGCGACACG—3'SEQIDNO.3：5'—GCCGAGCAAGAAACAACGC—3'二、PCR扩增条件优选根据前述的鉴别引物组和扩增产物的Tm值、长度设置PCR扩增反应体系与扩增程序，以白及、黄花白及和其近缘种(小白及、华白及)的基因组DNA为模板进行PCR扩增。其具体如下：PCR的反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液8μL，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3各3pmol，模板DNA20ng，ddH2O补足25μL。所述的PCR反应程序为95℃预变性1min，35个循环(95℃变性20s，62℃退火延伸30s)。a.前述的一组PCR鉴别引物及以其鉴别白及、黄花白及方法的PCR扩增程序优选如下：ⅰ退火延伸温度：考察了48℃、52℃、56℃、60℃、64℃、68℃的退火延伸温度。结果显示，52℃～68℃白及和黄花白及的扩增产物分别在354bp、519bp扩增出目的条带，条带亮度随温度的升高而增强，近缘种均未检测出条带。为保证退火延伸的有效进行，本专利技术选择退火延伸温度为66℃。图1为退火延伸温度优选的电泳检测图谱(M：D2000DNAMarker；1～4：白及、黄花白及、小白及、华白及)。ⅱ退火延伸时间：基于上述退火延伸温度的特征，考察1s、2s、5s、10s、20s、30s的退火延伸时间。结果显示，各退火延伸时间下，白及、黄花白及均能有效扩增，条带亮度随着时间的延长而增强，5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组PCR鉴别引物，其核苷酸序列为：SEQ ID NO.1：5'—GCCCAGAACAGCCATCCAAGT—3'SEQ ID NO.2：5'—TTGGCACGGAGCGACACG—3'SEQ ID NO.3：5'—GCCGAGCAAGAAACAACGC—3'

【技术特征摘要】
1.一组PCR鉴别引物，其核苷酸序列为：SEQIDNO.1：5'—GCCCAGAACAGCCATCCAAGT—3'；SEQIDNO.2：5'—TTGGCACGGAGCGACACG—3'；SEQIDNO.3：5'—GCCGAGCAAGAAACAACGC—3'。2.以权利要求1所述的一组PCR引物鉴别白及、黄花白及的方法，包括如下步骤：1)以待鉴定样品的基因组DNA为模板，使用前述的一组鉴别引物对其进行扩增；2)对步骤1)的PCR扩增产物进行电泳检测。3.根据权利要求2所述鉴别白及、黄花白及的方法，其特征在于，步骤1)所述的PCR反应体系为25μL，包括Taq酶PCR预混液6～8μL，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3各2～5pmol，模板DNA20ng～160ng，ddH2O补足25μL；所述的PCR反应程序为95℃预变性1mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：周涛，赵丹，黄璐琦，袁媛，肖承鸿，江维克，
申请(专利权)人：贵阳中医学院，中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52