DNA标签、PCR引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了DNA标签、PCR引物及其应用，其中一组DNA标签，其由SEQ ID NO：79-129所示的核苷酸构成。本发明专利技术的一组DNA标签能够用于构建核酸测序文库，以精确地对核酸测序文库进行区分。利用上述DNA标签，通过将DNA标签与DNA或其等同物相连，可以精确地表征DNA的样品来源。

【技术实现步骤摘要】
DNA标签、PCR引物及其应用
本专利技术涉及耳聋基因检测
，具体地，涉及DNA标签、PCR引物及其应用，更具体地，涉及一组分离的DNA标签、一组分离的PCR引物、一种构建核酸测序文库的方法、一种核酸测序文库、一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法、一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法以及一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒。
技术介绍
耳聋是人类常见疾病之一，2006年底第二次全国残疾人抽样调查结果显示，我国听力残疾者共有2670万人，占残疾人总数的19.3％。1-7岁听力障碍儿童为80万,每年新生聋儿超过3万。导致耳聋的原因有环境因素、遗传因素或者环境因素与遗传因素共同作用。其中遗传因素是主要的部分，据报道，有60％的耳聋是由遗传缺陷引起的。遗传性耳聋根据遗传方式不同可分为常染色体显性遗传(DFNA)、常染色隐性遗传(DFNB)、X连锁遗传(DFN)和线粒体遗传(DFNM)。根据是否伴有其他临床症状，遗传性耳聋可分为综合征性耳聋(SHL)和非综合征性耳聋(NSHL)，非综合征性耳聋具有高度遗传异质性，迄今为止，已定位了100多个NSHL相关位点，克隆了46个基因。遗传性耳聋不仅影响到患者学习、生活和工作，而且还可以通过基因遗传，将致聋基因传递给后代。因而，耳聋基因检测意义重大。然而，现阶段的耳聋基因检测技术仍有待改进。
技术实现思路
需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前，耳聋基因检测技术主要包括直接测序法(DS)、限制酶切指纹-单链构象多态性分析(REF-SSCP)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、ARMS-PCR法和生物芯片等。然而，现阶段的耳聋基因检测技术仍有待改进。具体地：直接测序法(DS)是将聚合酶链式反应(PCR)扩增产物纯化、变性后，在测序仪上进行测序，然后寻找突变，然而，该方法成本较高，耗时长，而且通量不高。限制酶切指纹-单链构象多态性分析(REF-SSCP)的原理是在聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA的迁移率除与DNA长度与DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段的基因变异存在。这种方法不能确定变异的位置，需对异常构象带序列进行DNA测序确定突变位点。限制性片段长度多态性分析(RFLP)是通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，消化PCR产物，经电泳，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。这种方法与REF-SSCP一样，需对异常构象带序列进行DNA测序确定突变位点。此外，由于受酶切位点的限制，所以这种方法检出率较低。变性高效液相色谱分析(DHPLC)的原理是应用离子对反向液相色谱技术，通过独特的DNA分离基质，对特定的PCR扩增产物进行分离。这种方法不能鉴定出具体的碱基突变位置，在筛选新的突变或多态性时，需要进行测序才能得出最后的结论。ARMS-PCR法的是利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。目前市售的遗传性耳聋基因检测芯片可同时检测中国人4个耳聋相关基因的9个突变热点，该方法检测位点相对较少，而且成本较高。本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够高通量、低成本、快速高效地对DNA样品尤其是多个DNA样品进行多位点的耳聋基因突变检测的方法。因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一组DNA标签。根据本专利技术实施例的一组DNA标签，其由SEQIDNO：79-129所示的核苷酸构成。本专利技术的一组DNA标签能够用于构建核酸测序文库，以精确地对核酸测序文库进行区分。利用上述DNA标签(在本文中有时也称为“核酸标签”)，通过将DNA标签与DNA或其等同物相连，可以精确地表征DNA的样品来源。由此，利用上述DNA标签，可以同时构建多种DNA样品的用于测序的核酸测序文库(在本文中，有时也称为DNA标签文库)，从而可以通过将来源于不同样品的核酸测序文库进行混合，同时进行测序，基于DNA标签对获得的测序序列进行分类，获得多种DNA样品的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用IonProtonTM或IonPGMTM测序技术，同时对多种DNA进行测序，从而提高DNA测序的效率和通量。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一组PCR引物。根据本专利技术实施例的一组PCR引物，其由SEQIDNO：1-78所示的核苷酸构成。本专利技术的一组PCR引物分别与耳聋基因GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因特异相关，利用该组PCR引物将DNA样品进行PCR扩增，能够一步PCR扩增39个耳聋基因片段，经过测序即可快速获取其DNA序列，耳聋基因检测通量高，突变位点分辨能力和灵敏度好。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还提供了一组标签PCR引物。根据本专利技术实施例的一组标签PCR引物，其是通过将前面所述的一组DNA标签中的任意一种连接至前面所述的一组PCR引物的5’末端而获得的。因而，本专利技术的一组标签PCR引物，可以有51种形式，进而利用本专利技术的一组标签PCR引物可以一次对51种DNA样品进行耳聋基因的突变检测。根据本专利技术的又一方面，本专利技术还提供了一种构建核酸测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：将DNA样品进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物，其中所述PCR扩增采用前面所述的一组标签PCR引物进行；以及纯化回收所述PCR扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。利用该方法，能够有效地将根据本专利技术实施例的DNA标签引入到针对DNA样品所构建的用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的核酸测序文库中，从而可以通过对核酸测序文库进行测序，获得DNA样品的核酸测序文库的序列信息以及DNA标签的序列信息，从而能够对多种DNA样品的核酸测序文库的序列信息的来源进行区分，进而能够有效确定所述多种DNA样品的每一种的核酸测序文库的序列信息，从而能够分别确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变，提高了耳聋基因突变检测的通量、效率和准确度。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还提供了一种确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：根据前面所述的构建核酸测序文库的方法，构建所述DNA样品的核酸测序文库；对所述核酸测序文库进行测序，以便确定所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息；以及基于所述DNA样品的核酸测序文库的序列信息，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。基于该方法，能够有效地对DNA样品进行耳聋基因突变检测，确定所述DNA样品耳聋基因是否存在突变。根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的方法，其中所述耳聋基因为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组DNA标签，其由SEQ ID NO：79‑129所示的核苷酸构成。

【技术特征摘要】
1.一组DNA标签，其由SEQIDNO：79-129所示的核苷酸构成。2.一组PCR引物，其由SEQIDNO：1-78所示的核苷酸构成。3.一组标签PCR引物，其是通过将选自权利要求1所述的一组DNA标签中的任意一种连接至权利要求2所述的一组PCR引物的5’末端而获得的。4.一种构建核酸测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：将DNA样品进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物，其中所述PCR扩增采用权利要求3所述的一组标签PCR引物进行；以及纯化回收所述PCR扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述核酸测序文库。5.一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因，其特征在于，所述试剂盒包括：51种DNA标签，所述DNA标签由SEQIDNO：78-129所示的核苷酸构成；以及78种PCR引物，所述PCR引物由SEQIDNO：1-78所示的核苷酸构成，其中，所述51种DNA标签和78种PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。6.一种用于确定DNA样品耳聋基因是否存在突变的试剂盒，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因，其特征在于，所述试剂盒包括：51组标签PCR引物，其中每一组所述标签PCR引物均是通过将选自权利要求1所述的一组DNA标签中的任意一种连接至权利要求2所述的一组PCR引物的5’末端而获得的，所述51组标签PCR引物的每一种分别设置在不同的容器中。7.一种确定多种DNA样品耳聋基因是否存在突变的系统，其中所述耳聋基因为GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因，其特征在于，包括：文库构建装置，所述文库构建装置包括标签PCR引物单元，其内设置有权利要求3所述的一组标签PCR引物，所述文库构建装置用于针对所述多种DNA样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯大飞，邹婧，欧日晶，侯强，张俊青，程秀，易鑫，
申请(专利权)人：深圳华大基因医学有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44