诱导恶性干细胞制造技术

本发明专利技术的课题在于提供在癌治疗研究和癌治疗的药物开发研究中有用的、能够在体外增殖的诱导恶性干细胞、它们的制造方法、由这些细胞所诱导的癌细胞、以及这些细胞的应用。本发明专利技术提供能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于，满足下述(1)和(2)的条件：(1)具有选自(a)内源性基因组DNA的抑癌基因或癌相关基因区域的甲基化异常(高甲基化或低甲基化)、(b)内源性基因组DNA的抑癌基因的体细胞突变或内源性癌相关基因的体细胞突变、(c)内源性癌基因或内源性抑癌基因的表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(d)内源性的癌相关微小RNA这样的非编码RNA的表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(e)内源性的癌相关蛋白质表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(f)内源性的癌相关代谢异常(代谢亢进或代谢降低)、或(g)内源性的癌相关糖链的异常中的至少1种异常；(2)表达POU5F1基因、NANOG基因、SOX2基因、ZFP42基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导恶性干细胞
本专利技术涉及诱导恶性干细胞，涉及具有与癌相关的基因组的异常或表观遗传的异常、并且表达P0U5F1基因(也称为0CT3/4基因)、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因这4种基因的、能够在体外(in vitro)增殖的诱导恶性干细胞、它们的制造方法、从这些细胞诱导得到的癌细胞以及这些细胞的应用。
技术介绍
近年来，通过以克隆动物的创建和胚胎干细胞(也称为“ES细胞”。在本说明书中，以下，记作“胚胎干细胞”)为代表的干细胞的研究，开始认为能够将表观遗传(DNA甲基化和组蛋白的修饰)重编程(也称为“初期化”。在本说明书中，以下记作“重编程”。)。实际上，报道了如下的实验结果在去核的卵细胞中移植作为癌细胞的小鼠黑色素瘤细胞的核，贝U该卵细胞开始胚胎发育，从该胚胎所得到的胚胎干细胞(也称为“ES细胞”。)分化成黑素细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等细胞(非专利文献I)。 最近，有如下报道:通过0CT3/4基因(有时也标记为“0CT3基因”、“0CT4基因”、或“P0U5F1基因”)、 S0X2基因、KLF4基因和c_MYC基因(专利文献I)的导入、或者在碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)存在下的0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因(非专利文献2)的导入，能够从人的体细胞重编程制作称为诱导多能性干细胞这样的与胚胎干细胞同样的未分化细胞(专利文献2)。已知人诱导多能性干细胞(induced Pluripotent Stem Cells ；以下也称为“iPS细胞”。)具有如下两个特征:(1)向能够成为形成身体的所有细胞的三胚层的分化多能性，和(2)在人胚胎干细胞的增殖培养条件下，维持其未分化性的状态，能够在培养皿中无限传代培养的增殖能力(自我复制能力)。并且，该人诱导多能性干细胞在形态、基因表达、细胞表面抗原、长期增殖能力(自我复制能力)、畸胎瘤(在体内(in vivo)向三胚层的分化)形成能力上，与人胚胎干细胞非常类似(非专利文献3、非专利文献4)，此外，还报道了 HLA的基因型与作为来源细胞的体细胞完全相同(非专利文献4)。可以认为，这些细胞的制作方法，仅通过导入上述基因(即，0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c-MYC基因、或者bFGF存在下的0CT3/4基因、S0X2基因和KLF4基因)，可以使分化后的体细胞向诱导多能性干细胞(iPS细胞)“重编程”。 一般而言，基于与癌相关的基因组的异常和/或表观遗传的异常，发生基因表达上升?低下或消失这样的异常，由此，细胞癌化。因此，可以认为，如果使用如上所述的重编程的技术，将癌细胞中发生的各种异常重编程，恢复为正常的细胞，消除癌细胞的性质。 实际上，最近，在国际干细胞学会(ISSCR)中，发表了:“在培养皿中对源自人肝癌细胞株的癌干细胞(源自HuH7的CD133阳性细胞)添加抗癌剂等2种化学物质(非环式维甲酸和托瑞司他(Tolrestat))，则在2天后，85~90%的癌细胞变为正常的肝脏细胞。此外，如果添加2个基因(S0X2基因和KLF4基因)和2种化学物质(5-AZAC和TSA)，则变成iPS细胞，通过向肝细胞的分化操作程序(Protocol)，成功使所得到的诱导多能性干细胞分化成肝细胞(AFP或ALB阳性细胞)”(非专利文献5)。另外，报道了使作为癌细胞的小鼠黑色素瘤细胞向诱导多能性干细胞重编程的论文(非专利文献6)、和通过0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c-MYC基因的导入而被重编程的结果，从具有作为致癌的原因的BCR-ABL酪氨酸激酶活性的慢性髓性白血病(CML)的细胞株，制作BCR-ABL酪氨酸激酶依赖性消失的iPS细胞(非专利文献7)。此外，还报道了:在癌细胞株中导入0CT3/4基因、S0X2基因、KLF4基因和c-MYC基因，通过重编程，耐药性和肿瘤形成能力消失，但是长期培养后，伴随导入细胞的基因组中的外来性c-MYC基因的活性化而发生癌化(非专利文献8)。 然而，自我复制相关基因(0CT3/4、S0X2、NANOG、ZFP42等)的表达未被充分诱导，而将作为致癌原因的c-MYC基因导入了细胞的基因组(非专利文献8)中。这样，赋予基因、化学物质使细胞恢复正常的重编程疗法被期待参与癌的治疗，正在进行研究(非专利文献9)。 然而，即使癌细胞被重编程为正常细胞，为了实际上实现癌治疗，不仅需要培养皿中、而且需要生物体中的癌细胞以100%的效率重编程为正常细胞。而且，一般认为即使是由图像检查发现的早期癌也有I亿个癌细胞，假设实现了以99.9%的效率将癌细胞重编程为正常细胞，也会残留10万个癌细胞，因此如果上述重编程的效率不为100%,则不能说是有效的癌治疗方法。 在以往的癌研究中，使用如下得到的癌细胞株:将外来性的SV40、HPV的E6基因、E7基因、TERT基因导入细胞的基因组，通过由强制表达的细胞的永生化培养、或者通过将c-MYC基因、RAS基因等癌基因导入细胞的基因组中进行永生化或癌化等构建癌细胞株后，进一步用通常的现有培养基培养得到癌细胞株。 然而，在不进行这样的基因的导入的情况下，用通常的现有通用培养基构建的癌细胞株中，在长时间培养中，显著发生培养后的人工的(In vitro Artifact)染色体异常(转座、缺失等)、基因组异常(基因突变)或成为基因表达异常的原因的表观遗传的异常(非专利文献10)。因此，存在如下问题:难以将In vitro Artifact的异常抑制到最小限度，难以将原本在生物体内成为致癌或恶性化的原因的癌细胞中所发生的突变等的异常原样保持在细胞中。这些细胞株都不是通过在体外使其自我复制的培养而构建、维持的细胞株。 在癌治疗的研究和癌相关药物开发的研究中，即使分析由这样的现有的通用培养基长时间培养的癌细胞株的基因组异常和表观遗传的异常，判别这些异常是在哺乳动物的原本生物体内作为致癌或恶性化的原因在癌细胞中发生的异常，还是在培养中发生的Invitro Artifact的异常，这特别困难或者不可能，因此，难以根据这些分析结果进行适当的致癌或恶性化的原因解明。使用这样的细胞进行癌治疗药物开发靶点的探索、癌治疗药候选物的筛选等并不适合。 另外，尽管作为药物开发的靶点，癌干细胞的存在受到重视，但是新鲜的癌组织所含的癌细胞为层次性的、且为异质的细胞团，因此存在鉴定哪个癌细胞为癌干细胞并不容易的问题。近年来，报道了用于从癌细胞株或初代培养癌细胞鉴定癌干细胞的研究(非专利文献11)，但是不仅没有使单克隆癌干细胞在体外增殖、实现长期培养的报道，而且还没有关于使其增殖到在体外应用于药物开发、或者用于癌研究所必要的数量的扩增培养的技术的报道。 如上所述，作为临床检体的癌组织所含的细胞为异质的细胞团，与多种正常细胞、非癌细胞和癌细胞混合存在。同样地，癌组织所含的癌细胞为层次性的，还不是克隆性的细胞团(非专利文献12)。近年来，以新一代的测序仪为代表的能够提供庞大的分析结果的大规模的多层组学分析风靡一时。然而，在分析对象为层次性的且不是克隆性的异质的癌组织的分析中，作为结果显示的是癌细胞团的平均的基因组、或占最多数的癌细胞团的基因组的数据，其结果，存本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于，满足下述(1)和(2)的条件：(1)具有选自(a)内源性基因组DNA的抑癌基因或癌相关基因区域的甲基化异常(高甲基化或低甲基化)、(b)内源性基因组DNA的抑癌基因的体细胞突变或内源性癌相关基因的体细胞突变、(c)内源性癌基因或内源性抑癌基因的表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(d)内源性的癌相关微小RNA这样的非编码RNA的表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(e)内源性的癌相关蛋白质表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(f)内源性的癌相关代谢异常(代谢亢进或代谢降低)、(g)内源性的癌相关糖链的异常、(h)内源性基因组DNA基因拷贝数多态性异常、或者(i)诱导恶性干细胞的内源性基因组DNA微卫星的不稳定性中的至少1种异常；并且(2)表达POU5F1基因、NANOG基因、SOX2基因、ZFP42基因这4种基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.30 US 61/565,0641.一种能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于，满足下述(I)和(2)的条件: (1)具有选自(a)内源性基因组DNA的抑癌基因或癌相关基因区域的甲基化异常(高甲基化或低甲基化)、(b)内源性基因组DNA的抑癌基因的体细胞突变或内源性癌相关基因的体细胞突变、(c)内源性癌基因或内源性抑癌基因的表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(d)内源性的癌相关微小RNA这样的非编码RNA的表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(e)内源性的癌相关蛋白质表达异常(表达上升或表达降低/消失)、(f)内源性的癌相关代谢异常(代谢亢进或代谢降低)、(g)内源性的癌相关糖链的异常、(h)内源性基因组DNA基因拷贝数多态性异常、或者(i)诱导恶性干细胞的内源性基因组DNA微卫星的不稳定性中的至少I种异常；并且 (2)表达P0U5F1基因、NANOG基因、S0X2基因、ZFP42基因这4种基因。2.如权利要求1所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 所述(I) (a)内源性基因组DNA的抑癌基因或癌相关基因区域的甲基化异常为以下的表1所示的基因组DNA(基因符号_N0.)的存在于从基因组起始点的位置到基因组终止点的位置的CpG的胞嘧啶碱基(C)的5位的甲基化异常。 [表1] 表1:发生条件(I) (a)甲基化异常的抑癌基因或癌相关基因区域3.如权利要求1所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 所述(I) (b)内源性基因组DNA的抑癌基因的体细胞突变或内源性癌相关基因的体细胞突变包括乘客突变。4.如权利要求1所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 所述(I) (b)内源性基因组DNA的抑癌基因的体细胞突变或内源性癌相关基因的体细胞突变为驱动突变。5.如权利要求1、3或4所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 所述(I) (b)内源性基因组DNA的抑癌基因的体细胞突变或内源性癌相关基因的体细胞突变在以下的表2所记载的基因中的至少一个中发生，或者在以下的表3所记载的基因的氨基酸突变(突变ID)中的至少一个中显示， [表2] 表2:发生条件⑴(b)体细胞突变的抑癌基因或内源性癌相关基因[表3] 表3:发生条件(I) (b)体细胞突变的抑癌基因或内源性癌相关基因6.如权利要求1所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 所述(I) (c)内源性癌基因或内源性抑癌基因的表达异常(表达上升或表达降低/消失)是在(I) (b)中所记载的基因的至少一个中发生的。7.如权利要求6所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 内源性癌基因或内源性抑癌基因的表达异常为内源性癌基因的表达上升或内源性抑癌基因的表达降低/消失。8.如权利要求1所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 所述⑴⑷内源性的癌相关微小RNA这样的非编码RNA的表达异常(表达上升或表达降低/消失)是在以下的微小RNA中所列举的微小RNA中的至少一个微小RNA中发生的。[表4] 表4:发生条件⑴(d)表达异常的癌相关微小RNA9.如权利要求1所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 所述(I) (e)内源性的癌相关蛋白质表达异常是与诱导多能性干细胞相比，显示蛋白质的表达上升或表达降低/消失，或者通过表达癌特异抗原而发生的。10.如权利要求9所述的能够在体外增殖的诱导恶性干细胞，其特征在于: 显示表达异常(表达上升或表达降低/消失)的蛋白质或癌特异抗原为Muc-1、VEGF-C,HnRNP A2/B1、E2F3、MAGE A4、MMP_9、细胞角蛋白-19、E2Fl、c-kit、Muc_4、细胞角蛋白-20、c-met、L-myc、MDRUhCG β、COX-2、CA125、MAGE A12、NSE、c_myc、CD44、Her2/Neu、RCASU bcl-2、FGFR2、HIF-1 a、GPC3、细胞周期蛋白 Dl、mdm2、细胞角蛋白-7、MMP-2、生存素、hT...

【专利技术属性】
技术研发人员：石川哲也，
申请(专利权)人：日本国立癌症研究中心，LSIP基金运营联合公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP