本发明专利技术公开了一种酿酒酵母整合型表达载体。本发明专利技术提供了一种双链DNA片段，自上游至下游依次包括如下元件：酿酒酵母染色体上游同源臂、真核启动子、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因、真核转录终止序列和酿酒酵母染色体下游同源臂。本发明专利技术还保护含有所述双链DNA片段的质粒，即为酿酒酵母整合型表达载体，能够使外源或内源基因在酿酒酵母中表达，并且无需诱导，利用酿酒酵母生产目的蛋白，或用于基因工程菌株的代谢途径构建。本发明专利技术的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母的蛋白表达和代谢途径构建提供了很好的工具。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种酿酒酵母整合型表达载体。本专利技术提供了一种双链DNA片段，自上游至下游依次包括如下元件：酿酒酵母染色体上游同源臂、真核启动子、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因、真核转录终止序列和酿酒酵母染色体下游同源臂。本专利技术还保护含有所述双链DNA片段的质粒，即为酿酒酵母整合型表达载体，能够使外源或内源基因在酿酒酵母中表达，并且无需诱导，利用酿酒酵母生产目的蛋白，或用于基因工程菌株的代谢途径构建。本专利技术的酿酒酵母表达载体为酿酒酵母的蛋白表达和代谢途径构建提供了很好的工具。【专利说明】一种酿酒酵母整合型表达载体
本专利技术涉及一种酿酒酵母整合型表达载体。
技术介绍
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最密切的一种酵母。酿酒酵母是制作面包和馒头等食品及酿酒的传统微生物，是迄今为止最具生物安全性的微生物。同时，在现代分子和细胞生物学中，酿酒酵母被用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5- 10 μ m。其繁殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母是现代工业生物技术、保健品行业和医用生物技术中常用的微生物。由于酿酒酵母具有优良的发酵性能，如良好的鲁棒性、快速的细胞繁殖性、生产过程中耐受杂菌污染等特性，在工业生物技术中常被用作代谢工程途径改造的出发生物，经各种代谢通路途径改造后的酿酒酵母工程菌被用于大宗化学品和精细化工的生产，如燃料乙醇、麦角固醇等。另外，由于酿酒酵母属于真核生物且具有高生物安全性，在医用生物
和保健品行业也有广泛应用，如乙肝疫苗的生产，功能保健酵母的开发等。酿酒酵母表达载体是上述应用和研究不可缺少的工具，各种类型表达载体的构建工作越来越受到人们的重视。酿酒酵母的表达载体通常为质粒型表达载体。常用的质粒型表达载体属于大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体，操作时会将大肠杆菌的复制起始点和原核筛选标记(如氨苄青霉素抗性基因)带入酿酒酵母细胞中，存在隐性的生物安全问题。如果使用体内组装技术将质粒型表达载体转入酿酒酵母，虽然能去除原核生物的DNA原件，但增加了操作的复杂程度。除此之外，用质粒型表达载体构建工程菌存在质粒易丢失的问题，导致工程菌生产性能的不稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酿酒酵母整合型表达载体。本专利技术提供了一种双链DNA片段(真核元件组)，自上游至下游依次包括如下元件:酿酒酵母染色体上游同源臂、真核启动子、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因、真核转录终止序列和酿酒酵母染色体下游同源臂。所述酿酒酵母的IRES序列为酿酒酵母中具有内部核糖体进入位点并具有启动翻译功能的DNA序列。所述酿酒酵母的IRES序列具体可如序列表的序列I自5’末端第2312至2659位核苷酸所示。 所述真核启动子可为酵母的启动子，具体可为酿酒酵母的启动子。所述酿酒酵母的启动子具体可为酿酒酵母的ILV5基因启动子、酿酒酵母的TDH3基因启动子或酿酒酵母的ADH2基因启动子。所述酿酒酵母的ILV5基因启动子具体可如序列表的序列I自5’末端第1014至1567位核苷酸所示。所述酿酒酵母的TDH3基因启动子具体可如序列表的序列2所示。所述酿酒酵母的ADH2基因启动子具体可如序列表的序列3所示。所述真核转录终止序列可为酵母的转录终止序列，具体可为酿酒酵母的转录终止序列。所述酿酒酵母的转录终止序列可为酿酒酵母的URA3基因转录终止序列。所述酿酒酵母的URA3基因转录终止序列具体可如序列表的序列I自5’末端第3477至3551位核苷酸所示。所述酿酒酵母染色体上游同源臂，可为酿酒酵母染色体上的ISSrDNA的上游同源臂，具体可如序列表的序列I自5’末端第675至1007位核苷酸所示。所述酿酒酵母染色体下游同源臂，可为酿酒酵母染色体上的ISSrDNA的下游同源臂，具体可如序列表的序列I自5’末端第3558至3921位核苷酸所示。所述真核筛选基因可为营养缺陷型选择标记基因或抗生素选择标记基因，具体可为酿酒酵母的URA3基因。所述酿酒酵母的URA3基因具体可如序列表的序列I自5’末端第2673至3476位核苷酸所示。所述酿酒酵母的URA3基因具体可如序列表的序列I自5’末端第2673至3473位核苷酸所示。本专利技术还保护一种具有所述真核元件组的质粒(酿酒酵母整合型表达载体)。所述酿酒酵母整合型表达载体还包括原核元件组；所述原核元件组自上游至下游依次包括如下组件:原核复制起点和原核筛选基因。所述的原核复制起点具体可为pMBl的复制起始点。所述的原核筛选基因具体可为氨苄青霉素抗性基因。所述酿酒酵母整合型表达载体具体可为将序列表的序列I所示的质粒去除序列I自5’末端第1580至2296位核苷酸所示DNA片段后得到的质粒。所述真核元件组或所述酿酒酵母整合型表达载体可用于制备蛋白。应用所述真核元件组制备蛋白时，将目的蛋白的编码基因插入真核元件组的真核启动子和酿酒酵母的IRES序列之间，得到融合DNA分子，然后将融合DNA分子导入酵母菌株，通过所述融合DNA分子和酵母菌株的基因组DNA发生同源重组，将真核启动子、目的蛋白的编码基因、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因和真核转录终止序列整合入酵母菌株的基因组DNA中，通过培养菌株可以得到目的蛋白。所述真核启动子用于启动所述目的蛋白的编码基因的表达。所述真核筛选基因可以提供筛选重组菌的选择压力，以避免现有方法中的如下局限性:选择压力低，无法提高目的片段在宿主染色体上的拷贝数，使目的基因无法得到满意的表达量。所述酵母菌株可为酿酒酵母，具体可为酿酒酵母W303菌株。所述目的蛋白可为mCherry蛋白。所述mCherry蛋白的编码基因具体可如序列表的序列I自5’末端第1580至2296位核苷酸所示。本专利技术还保护一种制备蛋白的方法，是将目的蛋白的编码基因插入所述真核元件组的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间，得到融合DNA分子，将所述融合DNA分子导入酵母菌株并培养所述酵母菌株，得到所述目的蛋白。所述酵母菌株可为酿酒酵母，具体可为酿酒酵母W303菌株。所述目的蛋白可为mCherry蛋白。所述mCherry蛋白的编码基因具体可如序列表的序列I自5’末端第1580至2296位核苷酸所示。本专利技术还保护一种制备蛋白的方法，是将目的蛋白的编码基因插入所述酿酒酵母整合型表达载体的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间，得到重组质粒，获得所述重组质粒中的融合DNA分子(可通过酶切所述重组质粒的方式从重组质粒中获得融合DNA分子，也可将所述重组质粒作为模板，通过PCR扩增的方式获得融合DNA分子)，将所述融合DNA分子导入酵母菌株并培养所述酵母菌株，得到所述目的蛋白；所述融合DNA分子为将所述目的蛋白的编码基因插入所述真核元件组的所述真核启动子和所述酿酒酵母的IRES序列之间得到的DNA分子。所述酵母菌株可为酿酒酵母，具体可为酿酒酵母W303菌株。所述目的蛋白可为mCherry蛋白。所述mCherry蛋白的编码基因具体可如序列表的序列I自5’末端第1580至2296位核苷酸所示。应用本专利技术的方法制备蛋白时，转入酿酒酵母的DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双链DNA片段，自上游至下游依次包括如下元件：酿酒酵母染色体上游同源臂、真核启动子、酿酒酵母的IRES序列、真核筛选基因、真核转录终止序列和酿酒酵母染色体下游同源臂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺鹏，张新杰，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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