本发明专利技术公开了一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法。本发明专利技术利用分子生物学技术顺次将L-丝氨酸脱氨酶（L-serinedeaminase）的编码基因sdaA，及L-丙氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的转氨酶编码基因alaT和ilvE在谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S基因组顺序敲除，最终构建一株sdaA,alaT和ilvE组合敲除的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S-Ⅲ。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法。本专利技术利用分子生物学技术顺次将L-丝氨酸脱氨酶（L-serinedeaminase）的编码基因sdaA，及L-丙氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的转氨酶编码基因alaT和ilvE在谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S基因组顺序敲除，最终构建一株sdaA,alaT和ilvE组合敲除的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S-Ⅲ。【专利说明】一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法
专利技术涉及一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法及其应用，属于工业生物
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技术介绍
L-丝氨酸，化学名为α-氨基-β-羟基丙酸，分子式为C3H7NO3，分子量105.10。L-丝氨酸属于非必需氨基酸，具有许多重要的生理功能，在医药、食品、化妆品等领域具有较为广泛的应用。L-丝氨酸是一种瓶颈氨基酸，近年来，虽然有很多关于L-丝氨酸生产方法的研究报告，但迄今为止尚缺乏较为经济、有效的工业化生产方法，我国至今没有实现产业化，产品需求主要依赖进口。2010年我国丝氨酸市场需求量为350吨，其中国内生产的20%基本采用水解天然蛋白质的方法，该方法操作费时，收率和产量低，成本高，不适合大规模的生产，同时存在较为严重的污染问题。因此，研究和开发发酵法生产L-丝氨酸的新菌种、新工艺对于打破日本等国长期以来在L-精氨酸等品种上的垄断具有十分重要的意义，也将进一步提升我国发酵法生产氨基酸的整体技术水平，完善我国氨基酸工业，调整药用氨基酸的产品结构，满足国内药用氨基酸市场需求。目前，国内外生产L-丝氨酸的方法主要有化学合成法、蚕丝水解法、酶法、前体发酵法等生物法，但是利用糖质原料通过直接发酵法生产L-丝氨酸的报道较少。其中以甘氨酸为前体经丝氨酸羟甲基转移酶催化生产L-丝氨酸生产技术己经工业化，最近又开发了采用具有高活丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的甲醇同化菌由甘氨酸生产L-丝氨酸的方法，日本主要以甘氨酸为前体发酵 生产L-丝氨酸，但前体物价格昂贵，生产成本高。国内主要以蚕丝水解法生产L-丝氨酸，即将废蚕丝、蚕蛹、丝胶水解，以提取L-丝氨酸；此法操作复杂，需处理大量的洗脱液，所得的氨基酸常为混合氨基酸，还需进一步分离、精制，不适合大规模的生产。因此，由于生产技术难度高，生产成本大，价格居高不下，严重限制了 L-丝氨酸的应用。为了能够获得L-丝氨酸的高效生产菌株和简化下游产物的分离纯化工艺，在构建高产菌株的时候需要除了需要提高菌株目标产物生物合成途径的效率，还需考虑尽可能地减少代谢副产物的积累。谷氨酸棒杆菌是氨基酸生产的重要菌株，现已用于L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸的氨基酸的工业化生产。江南大学药学院制药工程实验室从土壤中筛选到一株能够利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062，通过随机诱变筛选和代谢工程改造获得的重组菌株能够利用蔗糖发酵大量积累L-丝氨酸，但是发酵液中还存在有L-丙氨酸和L-缬氨酸两种代谢副产物。谷氨酸棒杆菌中L-丝氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸三种氨基酸是以丙酮酸为中心代谢物形成代谢物三角，见图1。L-丝氨酸通过L-丝氨酸脱氨催化其脱水脱氨生成丙酮酸，另外两种副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸均是以丙酮酸为前体物质生物合成而来。L-丝氨酸向丙酮酸转化，一个方面是使得目标产物产量降低，产物丙酮酸积累会影响菌体生理特性的同时增加发酵液中L-丙氨酸和L-缬氨酸在的含量，两种氨基酸的积累不仅造成碳骨架和氮源的大量流失浪费，而且会增加下游产物的分离提取工艺的复杂性和影响中产物的纯度。
技术实现思路
本专利技术根据谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的同时，发酵液中积累L-丙氨酸和L-缬氨酸两种代谢副产物。本专利技术的目的在于，采用基因工程手段将催化相关代谢反应的酶编码基因在基因组水平实现敲除，减少通过L-丝氨酸脱氨酶(L-serine deaminase)催化L-丝氨酸向丙酮酸转化，以及丙酮酸生物合成L-丙氨酸和L -缬氨酸的能力，提高主产物L-丝氨酸积累的同时降低副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成能力。选择将L-丝氨酸脱氨酶(L-serine deaminase)的编码基因sdaA,以及L-丙氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的转氨酶编码基因和i7妨在谷氨酸棒杆菌SYPS-062AS基因组顺序敲除，最终构建一株S ?凡a 7a 和i 7妨共敲除的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的: 分别按照如下实验方案分别将和i7妨三个基因在基因组敲除，最终构建获得三重基因缺失的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II，具体构建过程如下: (1)基因扩增:根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计引物以谷氨酸棒杆菌SYPS-062 基因组DNA为模板，分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段，再将该片段连接至PMD19-T，对目的基因序列进行测序验证，确证重组克隆质粒序列的准确性； (2)重组敲除质粒的构建:将所述步骤(1)中的连接有目的片段的重组克隆质粒PMD19-T-供进行双酶切处理，将目的片段连接至相同双酶切处理的质粒pK19m0hsac凡转化至疋coli JM109感受态细胞，筛选验证阳性克隆； (3)基因的重组整合:提取步骤(2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒m^obsacB-geneX,电激转化至谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S及其系列衍生菌株感受态细胞，通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株。(4)重组菌株的验证:利用引物通过PCR扩增验证重组菌株。重复如上的实验，最终获得重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II (6)将重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Λ S及其系列衍生菌株Λ S-1, Δ S-1I和Λ S-1II进行摇瓶发酵实验，测定其L-丝氨酸的生产能力和副产物的积累情况，分别计算主副产物在占总产物的摩尔百分率。本专利技术的优点和积极效果如下: 本专利技术以L-丝氨酸产生菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S为出发菌株，协调发酵液中主要的三种代谢产物L-丝氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成和降解之间关系。三种氨基酸是以丙酮酸作为中心的代谢三角关系，L-丝氨酸通过降解途径生成丙酮酸，丙酮酸通过代谢转化为L-丙氨酸和L-缬氨酸，为了实现降低主产物的L-丝氨酸的降解，减少副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成。对于菌体自身代谢来讲，使得菌体在满足对两种副产物氨基酸需求的前提下最大程度限制其生物合成，实现代谢流向L-丝氨酸生物合成途径的迁移，经济性利用碳骨架和氮源；从菌株理性代谢改造和下游产物的分离提取关联性看，在进行菌株改造时需要充分考虑下游分离纯化工艺过程，如代谢副产物对于产物的分离纯化工艺和成本的影响，在设计菌株改造方案时全面理性设计。最终的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-3在发酵过程中能够防止L-丝氨酸通过转化为丙酮酸而降解，同时希望最大可能地本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种减少L‑丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS‑062代谢副产物的方法，其特征在于：将基因sdaA, alaT和ilvE在L‑丝氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌SYPS‑062△S基因组实现组合敲除，分别构建获得基因工程菌谷氨酸棒杆菌SYPS‑062△S‑I，谷氨酸棒杆菌SYPS‑062△S‑Ⅱ和谷氨酸棒杆菌SYPS‑062△S‑Ⅲ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，史劲松，罗玉常，窦文芳，张晓梅，张旦旦，陆震鸣，许鸿瑜，李恒，李会，耿燕，赵芹芹，方佳茂，陈伟滨，
申请(专利权)人：江南大学，广东环西生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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