编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的GAP基因的启动子的变体制造技术

技术编号:9769574 阅读:141 留言:0更新日期:2014-03-16 04:18
本发明专利技术涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸(编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的启动子的变体);以及涉及生产和/或分泌精细化学品的微生物,所述微生物包含具有启动子活性的分离的多核苷酸,其能使各种基因与特定的起始菌株相比过表达;以及涉及使用本发明专利技术的微生物制备制备精细化学品的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的GAP基因的启动子的变体本专利技术涉及使用遗传修饰的微生物来制备精细化学品的方法,在所述微生物中编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的启动子的变体使各种基因能够过表达。现有技术精细化学品(特别是指氨基酸、有机酸、维生素、核苷和核苷酸)被用于人类医学,用于药物、化妆和食品工业以及用于动物营养。许多这些化合物是通过发酵棒状杆菌的菌株来制备的,特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。由于非常重要,一直有努力在改善其生产方法。所述方法可以针对发酵相关的手段来进行改善,如例如,搅拌和氧气供应,或者针对营养培养基的组成如例如发酵期间的糖浓度,或者针对产物形式的建立例如通过离子交换层析的手段,或者针对微生物本身的内在性能特征。通过利用诱变、突变体的选择和挑选的方法来改善这些微生物的性能特征。以此方式获得了对于抗代谢物具抗性并产生化合物的菌株,所述抗代谢物如例如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸或者缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸,所述化合物例如L-氨基酸如L-赖氨或L-缬氨酸。多年来,重组DNA技术的方法已同样被用于改善产L-氨基酸的谷氨酸棒状杆菌菌株,其中通过例如 增强或减弱个体氨基酸生物合成基因,以及研究对所述化合物生产的作用。关于谷氨酸棒状杆菌的生物学、遗传学和生物技术的总结可以参见“Handbook ofCorynebacterium glutamicum,,(Eds.:L.Eggeling和M.Bott,CRC Press,Taylor&Francis,2005), Journal of Biotechnology 的特刊中(主编:A.PUhle;r)题目为A New Era inCorynebacterium glutamicum Biotechnology^(Journal of Biotechnology104/1-3,(2003)),以及 T.Scheper(总编辑)的书Microbial Production of L-aminoacids (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology79, Springer Verlag,Berlin, Germany, 2003)中。谷氨酸棒状杆菌基因组的核苷酸序列在Ikeda和Nakagawa的(AppliedMicrobiology and Biotechnology62,99-109 (2003))中,以及在 EP1108790 和 Kalinowski等人(Journal of Biotechno logy 104/1-3, (2003))中有描述。谷氨酸棒状杆菌基因组的核苷酸序列从National Library of Medicine(Bethesda, MD, USA)的 National Center for Biotechnology Information (NCBI)中的数据库、从 DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Mishima, Japan)、或者从 European MolecularBiologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany,和 Cambridge, UK)的核苷酸序列数据库获得。Patek et al (Journal of Biotechnologyl04, 311-323 (2003))已描述和分析了谷氨酸棒状杆菌编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的天然启动子。在US2008/0050786 中,SEQ ID NO: 20 示出了称作 seqP_RBS_20 的 484bp 的 DNA 分子,其含有包括了核糖体结合位点的gap基因的启动子。此启动子可有利地用于表达各种基因,如例如编码天冬氨酸激酶的lysC基因,。为清楚起见,该序列被列为SEQ ID N0:1。专利技术目标本专利技术的目标是提供编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因的启动子和/或表达单元的变体,在所述变体的控制下,各种基因,如例如编码天冬氨酸激酶的lysC基因可有利地表达。专利技术描述在进行本专利技术期间,发现SEQ ID勵:2所示的谷氨酸棒状杆菌八了0:130328&?基因启动子的活性,在用核碱基腺嘌呤置换所述启动子位置362处的核碱基鸟嘌呤之后得到了提闻。 在如下核碱基的置换后,发现了启动子活性的进一步提高:在SEQ ID N0:2所示的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032gap基因启动子中用胸腺嘧啶置换位置265处的胞嘧啶、用胞嘧啶置换位置269处的鸟嘌呤、用胸腺嘧啶置换位置290处的腺嘌呤、和用腺嘌呤置换位置292处的鸟嘌呤。因此,本专利技术涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸,其包含具有SEQ ID N0:3或SEQ ID NO: 34所示核苷酸序列的多核苷酸。本专利技术还涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸,其基本由具有SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:34所示核苷酸序列的多核苷酸组成。术语〃基本〃在此背景中是指,长度不超过(<)1000、不超过(()800、不超过(()700、不超过(()600、不超过(<)500或不超过(< )400个核苷酸的多核苷酸,和长度不超过(()15000、不超过(()10000、不超过(07500、不超过(<)5000、不超过(02500、不超过(<)1000、不超过(()800、不超过(<)700、不超过(()600、不超过(<)500或不超过(()400个核苷酸的多核苷酸被分别加至SEQIDN0:3或SEQIDN0:34的多核苷酸的5'端和3'端。两项列举中特征的任意有用组合都符合本文的专利技术。“有用组合”意指,例如导致实现有效重组的特征的组合。在要置换的DNA区域旁侧用相同长度添加会有助于该区域在实验过程中通过同源重组转移。相对长的旁侧同源区域对于环状DNA分子之间的有效重组是有利的,但是置换载体的克隆会随着旁侧长度的增加而变得更困难(Wang等人,Molecular Biotechnology32:43-53 (2006))。因此,优选在每种情况中添加600至不超过(()1000个核苷酸的特定组合,而特别优选在每种情况中添加750-850个核苷酸。本专利技术还涉及具有启动子活性的分离的多核苷酸,其由SEQ ID N0:3或SEQ IDNO:34所示的序列组成。关于多核苷酸存在于生命体(如例如微生物)中的生物化学和化学结构的细节,可参见 Berg et al 的教科书 “Biochemie” [生物化学](Spektrum Akademischer VerlagHeidelberg.Berlin, Germany,2003;ISBN3-8274-1303-6)。由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的脱氧核糖核酸单体组成的多核苷酸称作脱氧核糖多核苷酸或脱氧核糖核酸(DNA)。由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核糖核酸单体组成的多核苷酸称作核糖多核苷酸或核糖核酸(RNA)。所述多核苷酸中的单体通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有启动子活性的分离的多核苷酸,其包含具有SEQ?ID?NO:3或SEQ?ID?NO:34所示核苷酸序列的多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.28 DE 102011118019.61.具有启动子活性的分离的多核苷酸,其包含具有SEQID N0:3*SEQ ID NO:34所示核苷酸序列的多核苷酸。2.权利要求1的多核苷酸,特征在于其基本由具有SEQID N0:3或SEQ ID N0:34所示核苷酸序列的多核苷酸组成。3.权利要求1或2的多核苷酸,特征在于其由SEQID NO: 3或SEQ ID NO: 34所示的序列组成。4.权利要求3的多核苷酸,特征在于其在其3,端功能性地连接至第二多核苷酸,其中所述连接是直接连接或者通过接头寡核苷酸的方式连接、或者通过接头多核苷酸的方式连接,优选通过接头多核苷酸的方式连接,其中所述第二多核苷酸在其5,端含有ATG或GTG起始密码子并且编码疑惑多个多肽。5.权利要求4的多核苷酸,特征在于所述SEQID N0:3或SEQ ID N0:34的多核苷酸,经在其3’端位置461处的腺苷核苷酸,由长度1、2、3、4、或5个核苷酸的接头寡核苷酸连接至所述第二多核苷酸起始密码子的第一个核苷酸。6.权利要求4的多核苷酸,特征在于所述SEQID N0:3或SEQ ID N0:34的多核苷酸,经在其3’端的腺苷核苷酸,由长度从6至不超过(<)600个核苷酸、优选长度20、21、22、23、24、或25个核苷酸的接头多核苷酸,连接至所述第二多核苷酸起始密码子的第一个核苷酸。7.权利要求6的多核苷酸,特征在于所述接头多核苷酸包含确保所合成的RNA的翻译的核苷酸序列。8.权利要求6-7的多核苷酸,特征在于所述接头多核苷酸的序列基本上由SEQIDNO: 12或SEQ ID NO: 13中所示的核苷酸序列组成。9.权利要求6-8的多核苷酸,特征在于所述接头多核苷酸的序列由SEQID NO: 14,SEQID NO: 15、SEQ ID NO: 16、S`EQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18中所示的任何核苷酸序列组成。10.权利要求3的多核苷酸,特征在于其经过在SEQID NO: 3或SEQ ID NO:34的3’端位置461处的腺苷核苷酸,功能性地连接至接头寡核苷酸、或连接至接头多核苷酸,优选连接至确保RNA的翻译的接头多核苷酸。11.权利要求4-9的多核苷酸,特征在于编码一或多个多肽的第二多核苷酸由一或多个选自下列的多核苷酸组成:a)编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的Zwf亚基(Zwf,ECN0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(zwf基因),b)编码葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶的OpcA亚基(OpcA,ECN0.: 1.1.1.49)的多核苷酸(opcA 基因),c)编码6-磷酸葡糖酸内酯酶(DevB,EC N0.:3.1.1.31)的多核苷酸(devB基因),d)编码转酮醇酶(Tkt,ECN0.:2.2.1.1)的多核苷酸(tkt基因),e)编码转醛醇酶(Tal,ECN0.:2.2.1.2)的多核苷酸(tal基因),f)编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(Gnd,ECN0.: 1.1.1.44)的多核苷酸(gnd基因),g)编码核酮糖磷酸3-差向异构酶(Rpe,ECN0.:5.1.3.1)的多核苷酸(rpe基因),h)编码核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi,ECN0.:5.3.1.6)的多核苷酸(rpi基因),i)编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc,ECN0.:4.1.1.31)的多核苷酸(ppc基因),j)编码果糖1,6- 二磷酸酶(Fbp, EC N0.:3.1.3.11)的多核苷酸(fbp基因),k)编码丙酮酸羧化酶(Pyc,EC N0.:6.4.1.1)的多核苷酸(pyc基因),I)编码二氢吡啶二羧酸合酶(DapA,ECN0.:4.2.1.52)的多核苷酸(dapA基因),m)编码天冬氨酸-半醛脱氢酶(Asd,EC N0.:1.2.1.11)的多核苷酸(asd基因),η)编码内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(Ddh,EC N0.:1.4.1.16)的多核苷酸(ddh基因),ο)编码二氨基庚酸脱羧酶(LysA,EC N0.:4.1.1.20)的多核苷酸(lysA基因),P)编码天冬氨酸氨基转移酶(Aat,EC N0.:2.6.1.1)的多核苷酸(aat基因),q)编码具有L-赖氨酸输出活性的多肽(LysE,赖氨酸流出通透酶)的多核苷酸(lysE基因),r)编码二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB, EC N0.:1.3.1.26)的多核苷酸(dapB基因),s)编码天冬氨酸激酶(LysC,EC N0.:2.7.2.4)的多核苷酸(lysC基因),t)编码琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶,AT I类(DapC,EC N0.:2.6.1.17)的多核苷酸(dapC基因),u)编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(DapD,EC N0.:2.3.1.117)的多核苷酸(dapD基因),v)编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶 (DapE,EC N0.:3.5.1.18)的多核苷酸(dapE基因),w)编码二氨基庚二酸差向异构酶(DapF,EC N0.:5.1.1.7)的多核苷酸(dapF基因),X)编码乙酰乳酸合酶的亚基(IlvBN,EC N0.:4.1.3.18)的多核苷酸(ilvB基因和ilvN基因),y)编码还原异构酶(IlvC,EC N0.:1.1.1.86)的多核苷酸(ilvC基因),z)编码二羟酸脱水酶(IlvD,EC N0.:4.2.1.9)的多核苷酸(ilvD基因),aa)编码转氨酶(IlvE,EC N0.:2.6.1.42)的多核苷酸(ilvE基因),bb)编码苏氨酸脱水酶(IlvA,EC N0.:4.3.1.19)的多核苷酸(ilvA基因),cc)编码高丝氨酸脱氢酶(Horn, EC-N0.:1.2.1.11)的多核苷酸(hom基因),dd)编码高丝氨酸激酶(ThrB, EC-N0.:2.7.1.39)的多核苷酸(thrB基因),ee)编码苏氨酸合酶(ThrC,EC-N0.:4.2.3.1)的多核苷酸(thrC基因),ff)编码异丙基苹果酸合酶(LeuA,EC-N0.:2.3.3.13)的多核苷酸(leuA基因),gg)编码异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB, EC-N0.:1.1.1.85)的多核苷酸(leuB基因),hh)编码异丙基苹果酸异构酶的大亚基(LeuC,EC-N0.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuC基因),?)编码异丙基苹果酸异构酶的小亚基(LeuD,EC-N0.:4.2.1.33)的多核苷酸(leuD基因),jj)编码赖氨酸/鸟氨酸转运蛋白(DE申请号102010003419.3)的多核苷酸(lysE基因),kk)编码N-乙酰谷氨酸激酶(ArgB,EC-N0.:2.7.2.8)的多核苷酸(argB基因),II)编码谷氨酸脱氢酶(Gdh,EC-N0.: 1.4.1.3)的多核苷酸(gdh基因),mm)编码谷氨酸N-乙酰基转移酶(ArgJ,EC-N0.:2.3.1.35和EC_N0.:2.3.1.1)的多核苷酸(argj基因),nn)编码N-乙酰基-y-谷氨酰...

【专利技术属性】
技术研发人员:A·雷特B·巴特S·汉斯W·克莱斯
申请(专利权)人:赢创德固赛有限公司
类型:
国别省市:

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