一种油酸脱氢酶基因及其所编码的蛋白质制造技术

本发明专利技术公开了一种油酸脱氢酶基因及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域。播娘蒿油酸脱氢酶基因ＤｓＦＡＤ２的ｃＤＮＡ序列ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ．１及其编码的氨基酸序列ＳＥＱ？ＩＤ？ＮＯ．２。本发明专利技术基因为双子叶植物播娘蒿的首次报道，参与播娘蒿种子贮藏亚油酸的生物合成，ｍＲＮＡ表达分析表明该基因受伤害诱导，不受温度影响。转基因实验证明ＤｓＦＡＤ２基因转化油菜，可提高油菜中的亚油酸和亚麻酸含量；而转该基因反义片段则会抑制亚油酸合成，从而显著提高油菜籽油酸含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术公开了一种油酸脱氢酶基因及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域，具体地涉及到植物中油酸合成的关键酶及其编码基因。
技术介绍
油酸作为必须脂肪酸，在医疗、保健等方面具有重要作用，而A-油酸去饱和酶 (delta-12 oleate desaturase FAD2)是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶，催化油酸 脱饱和产生亚油酸。油酸脱氢酶只存在于植物和微生物中，在人和哺乳动物中不存在，所以 人体不能自身合成亚油酸，必须从体外摄取。人们先后从蓝细菌，拟南芥、芝麻、花生及棉花 中分离到质体或微粒体的油酸脱氢酶基因。 油酸脱氢酶的活性受温度调节，温度可以调控油酸的去饱和过程，从而控制油酸 的含量。然而，不同植物的油酸脱氢酶受温度的影响程度不同。 我们首次报道了双子叶植物播娘蒿的油酸脱氢酶基因。
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的在于公开一种油酸脱氢酶基因及其所编码的蛋白质，该基因来自播 娘蒿，可作为目的基因导入植物，抑制亚油酸的合成，促使油酸的更多积累，进行植物品种 改良。 技术方案 本专利技术油酸脱氢酶基因(DsFAD2)，其核苷酸序列SEQ ID NO. 1为 ACGAATGTGGCCACCACGCTTTCAGCGACTACCAGTGGCTAGATGACACAGT CCCCAAGAAGAAATCTGCAATCAAGTGGTACGGCAAATACCTCAACAACCCT CGATGTATAGGGAGGCAAAGGAGTGTATCTATGTAGAACCGGACAGGGAAGG TGAGAAGAAAGGTGTGTACTGGTACAACAATAAGTTATGAGGATGATGGTGA CGCTG。 上述的油酸脱氢酶基因(DsFAD2)基因来自播娘蒿，其编码的蛋白质来自播娘蒿 (Descurainia sophia)，它具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO. 2 : MGAGGRMPVPSSSKKSETDALKRVPCEKPPFSLGDLKKAIPPHCFKRSIPRSFSYL SDYQWLDDTVGLIFHSFLLVPYFSWKYSHRRHHSNTGSLERDEVFVPKKKSAIK WYGKYLNNPVGRIVMLIVQFTLGWPLYLAFNVSGRPYDGFACHFFPNAPIYNDR PSLPHYDSSEWDWLRGAMATVDRDYGILNKVFHNITDTHVAHHLFSTMPHYNA MEATKAIKPILGDYYQFDGTPWYKAMYREAKECIYVEPDREGEKKGVYWYNN KL。 有益效果 1、本专利技术公开了一种油酸脱氢酶基因(DsFAD2)及其所编码的蛋白质。油酸脱氢 酶基因在双子叶植物播娘蒿中是首次报道，可应用于双子叶植物的遗传改良。该基因来自 播娘蒿(Descurainia sophia)，转基因实验证明DsFAD2基因转化油菜，可提高油菜中的亚 油酸和亚麻酸含量；而转该基因反义片段则会抑制亚油酸合成，从而显著提高油菜籽油酸 含量。所编码的蛋白质具有油酸脱氢酶功能。 2、本专利技术人提供的DsFAD2基因能催化油酸脱饱和产生亚油酸。mRNA表达分析表 明DsFAD2基因属于组成型表达，但是DsFAD2基因在播娘蒿根和角果中表达量较高。 3、本专利技术的DsFAD2基因来自播娘蒿，具有适合于播娘蒿等双子叶植物表达的优 化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物，如小麦、玉米、水稻等之外更加适合于拟 南芥、油菜、烟草、棉花等双子叶植物。 4、利用本专利技术DsFAD2基因作为目的基因构建植物反义表达载体，以种子特异性 启动子，遗传转化油菜等双子叶植物，抑制亚油酸的合成，促使油酸的更多积累。转化可经 农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。具体实施方式 实施例1根据GenBank中拟南芥和其它物种FAD2序列设计了播娘蒿中DsFAD2引物FAD2P1和FAD2 P2。以播娘蒿角果总RNA为起始材料，经反转录得到的cDNA作为PCR扩增的模 板，运用引物组合FAD2 P1和FAD2 P2，进行PCR扩增，得到一条明亮的条带，测序。利用RACE 试剂盒的反转录体系，将播娘蒿角果总RNA反转录为cDNA作为模板，运用基因特异性引物 GST和锚定引物，进行PCR扩增，DsFAD2的特异性引物为5' FAD2 GST和3' FAD2 GST，分 别得到一条明亮的条带。测序后序列比对显示，它们都含有引物设计时保守区域重复的一 段序列，Blast搜索显示这些序列都很可能是这些基因所缺少的那一部分。根据上面的信 息在DsFAD2非编码区设计了它的全长引物DsFAD2. 1和DsFAD2. 2，上述所用引物如下 FAD2P1:5' -ACTTGCTTCCAGTGCCCTTA-3' FAD2P2:5' -TCGCAAAGTGCAATGTCTTC-3' 5' FAD2GST:5' -TCCTCTCTCCGATTCCCAC-3' 3' FAD2GST:5' -AAATCACTCACCAGTCACCACT-3' DsFAD2.1:5' -CTCCAGAAACATGGGTGC-3' DsFAD2.2:5' -CAGCGATGAGAAGAACAATAC—3' 并以全长引物DsFAD2. 1、 DsFAD2. 2进行PCR扩增得到特异性条带，获得播娘蒿油 酸脱氢酶基因的全长序列。以总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一条链后，用高保真Taq 酶(购自大连宝生物工程有限公司)进行PCR扩增。PCR程序如下94t:预变性3min，94t: 变性60s， 56复性90s， 72延伸2min， 32个循环后，72再延伸10min，最后4保存。PCR 回收产物连接到pMD19-T克隆载体上(购自大连宝生物工程有限公司)，转化到大肠杆菌 T0P10 (北京天为时代生物工程有限公司)，以来自目的片段上的引物序列为引物，进行PCR 扩增，鉴定阳性克隆；序列的测定委托上海Invitrogen生物技术有限公司完成。(见SEQ ID NO. 1)。 BLAST的结果及分子建模结果证明从播娘蒿中新得到的基因确为一个编码油酸脱 氢酶基因(delta-12 oleate desaturase FAD2)，该基因编码产物具有催化合成亚油酸的 功能。 实施例2 上述获得播娘蒿油酸脱氢酶基因DsFAD2的cDNA序列SEQ ID NO. 1，其编码的蛋白 质，来自播娘蒿(Descurainia sophia)，它的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2， DsFAD2cDNA全长 1343bp，0RF1152bp编码383个氨基酸，预测编码蛋白分子量为44. 1KD，等电点PI为8. 63。 根据氨基酸序列比对的结果显示，DsFAD2与其他作物中FAD2的一致性为90% _73%，其中 和拟南芥相似性最高为90% 。该序列有3个高度保守的组氨酸Boxes,这一特性是所有膜 结合去饱和酶的共同特性，这些组氨酸Boxes用以结合催化所需的两个铁离子，是去饱和 酶行使功能所必须的。它和其它作物中的FAD2 —样在N端没有明显的信号肽，但在C端发 现有一富含芳香族氨基酸的信号肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双子叶植物油酸脱氢酶基因（ＤｓＦＡＤ２），来自播娘蒿（Ｄｅｓｃｕｒａｉｎｉａ　ｓｏｐｈｉａ），命名为ＤｓＦＡＤ２基因，其核苷酸序列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１为：　　ＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＴＡＧＡＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＡＡＡＧＣＧＧＧＴＧＣＣＧＴＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＧＣＴＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＣＧＣＡＴＴＧＴＴＴＣＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＡＡＧＴＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧＴＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＴＡＡＴＣＴＴＡＴＴＧＴＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＡＡＡＴＴＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＣＧＣＴＧ。ＣＴＣＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＡＴＣＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＡＧＴＣＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴＡＣＴＡＴＧＴＣＧＣＣＡＣＣＡＡＴＴＡＣＴＴＣＴＣＴＡＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＡＴＡＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＡＣＣＧＧＴＧＴＴＴＧＧＧＴＣＡＴＡＧＣＣＣＡＣＧＡＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＧＧＴＣＴＴＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＡＣＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＴＧＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＡＡＴＣＡＡＧＴＧＧＴＡＣＧＧＣＡＡＡＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＧＴＧＡＴＧＴＴＧＡＴＴＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＣＴＧＧＣＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＴＣＧＧＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣＧＣＴＣＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＧＧＧＡＡＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＧＡＴＧＣＣＧＧＴＡＴＴＣＴＣＧＣＴＧＴＣ...

【技术特征摘要】
一种双子叶植物油酸脱氢酶基因(DsFAD2)，来自播娘蒿(Descurainia sophia)，命名为DsFAD2基因，其核苷酸序列SEQ ID NO.1为CTCCAGAAACATGGGTGCAGGTGGTAGAATGCCGGTTCCTTCTTCTTCCAAGAAATCGGAAACCGATGCTCTAAAGCGGGTGCCGTGCGAGAAACCGCCTTTCTCGCTGGGAGATCTTAAGAAAGCTATCCCACCGCATTGTTTCAAACGCTCAATCCCTCGCTCTTTCTCCTACCTTATCACTGACATCATTATAGTCTCATGCTTCTACTATGTCGCCACCAATTACTTCTCTATCCTCCCTCACCCTCTCTCTTACTTGGCTTGGCCCCTATATTGGGTCTGTCAAGGCTGTGTCCTTACCGGTGTTTGGGTCATAGCCCACGAATGTGGCCACCACGCTTTCAGCGACTACCAGTGGCTAGATGACACAGTCGGTCTTATCTTCCATTCTTTCCTCCTTGTCCCTTACTTCTCCTGGAAATACAGCCATCGCCGTCACCATTCCAACACGGGTTCCCTCGAAAGAGATGAAGTGTTTGTCCCCAAGAAGAAATCTGCAATCAAGTGGTACGGCAAATACCTCAACAACCCTGTTGGGCGAATCGTGATGTTGATTGTCCAGTTCACCCTCGGCTGGCCATTGTACTTGGCCTTCAATGTCTCGGGCAGACCCTATGACGGCTTTGCATGCCATTTCTTCCCAAACGCTCCCATCTACAACGACCGGGAACGCCTCCAGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：管荣展，张红生，唐三元，陈健美，田琳琳，郑秀，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]