依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及依非韦伦(EFV)肝细胞毒性分子标志物及其应用，尤其涉及D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。本发明专利技术通过肝毒性的细胞模型，用蛋白质组学方法筛选以及荧光定量PCR和免疫印迹实验，获得与肝细胞毒性正相关的蛋白质D-3-磷酸甘油脱氢酶；该蛋白质在不同浓度的EFV处理组中均比未经处理的高表达，且该D-3-磷酸甘油脱氢酶与EFV肝细胞毒性呈正相关。本发明专利技术结果表明，以该蛋白质的转录本作为一个分子标志对其转录水平进行定量检测可用作检测EFV肝细胞毒性。所述的D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性的引物与抗体可用于制备检测EFV肝细胞毒性制剂，和制备检测EFV肝细胞毒性的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用
本专利技术属于生物
，涉及依非韦伦(efavirenz，EFV)肝细胞毒性分子标志物及其应用，具体涉及D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。
技术介绍
艾滋病全称为“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)。截至2010年底，我国确诊艾滋病病毒感染者和病人约37万，其中2010 年新发艾滋病人数15982例，给我国政治和经济造成极大的影响。高效联合抗逆转录病毒治疗(Highly Active Antiretroviral Therapy,HAART)是目前治疗艾滋病最主要的方案， 是改善患者预后，提高患者生存质量的主要途径。目前有如下5类药物可供临床选择:核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂及融合抑制剂。其中NNRTI类药物有3个:依非韦伦(efavirenZ，EFV)、奈韦拉平 (nevirapine, NVP)和地拉韦啶(delavirdine)。依非韦伦EFV为国际艾滋病治疗指导方针推荐的非核苷类(NNRTI)首选药物，联合2个核苷类(NRTI)药物可作为抗HIV感染的一线治疗方案。但是EFV耐药屏障低[1]，HIV-1反转录酶(RT)单一位点突变株对依非韦伦耐药，为此临床和科研工作者进行大量的病毒耐药基因检测工作；此外，EFV有较严重的肝损，皮肤过敏反应和神经系统毒性U2。队列研究1显示:EFV治疗导致8.0%肝损伤(312个入选患者)，NVP治疗肝损伤的比率为15.6% (256例入选)。结核3、病毒性肝炎及联合应用蛋白酶抑制剂(PD会增加肝损伤的比率。人体CYP2B6代谢酶的多态性是EFV肝毒性的一个重要原因。Katsounas A等4 对576艾滋病患者进行依非韦伦EFV血药浓度检测，发现EFV的浓度在1000-4000ng/mL之间能较好的控制HIV，超过4000ng/mL容易引起肝毒性。对于基因型为CYP2B6*6/6*或者 *6/26*的患者均出现516位的G变为T(516G- > T)，EFV的代谢减慢，导致血药浓度高达 6000ng/mL,出现神经毒性和肝毒性。当药物剂量被减少到400或200mg/天(标准剂量为 600mg/天)时，症状得到缓解5。根据最新研究，另一个重要原因是EFV即使在临床浓度仍然能诱导细胞凋亡。EFV 能降低线粒体膜通透性、提高过氧化物等的产生、导致线粒体质量提高；EFV抑制O2消耗， 降低细胞内ATP的水平；EFV诱导细胞自吞。寻找线粒体凋亡过程中的变化分子，将能为EFV 肝毒性的预警提供标识分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供依非韦伦肝细胞毒性分子标志物及其应用，具体涉及 D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测肝细胞毒性分子标志物中的用途。本专利技术通过蛋白质组学的方法在依非韦伦(EFV)肝细胞毒性模型中发现NADH脱氢酶为与肝毒性成正相关的蛋白质，经定量PCR和免疫印迹实验从mRNA和蛋白质的水平验证了该蛋白质的表达。本专利技术实验结果显示，D-3-磷酸甘油 脱氢酶可用作检测EFV肝细胞毒性的分子标志。本专利技术通过建立肝毒性的细胞模型，利用蛋白质组学方法筛选在依非韦伦EFV处理致线粒体毒性和未经处理的肝细胞中差异表达的蛋白质，结果显示了与肝细胞毒性正相关的蛋白质(在EFV处理组中高表达)，经质谱鉴定确定为D-3-磷酸甘油脱氢酶；进一步的荧光定量PCR和免疫印迹实验证实，该蛋白质在不同浓度的EFV处理组中均比未经处理的高表达，且该D-3-磷酸甘油脱氢酶与EFV肝细胞毒性呈正相关。本专利技术结果表明，以该蛋白质的转录本作为一个分子标志对其转录水平进行定量检测可用作检测EFV肝细胞毒性。本专利技术的另一个目的在于提供D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性的引物与抗体(包括单克隆抗体和多克隆抗体)，用于制备检测EFV肝细胞毒性制剂。本专利技术的再一个目的在于提供一种D-3-磷酸甘油脱氢酶的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，用于制备检测EFV肝细胞毒性的试剂盒。本专利技术的进一步目的在于提供一种体外检测EFV肝细胞毒性细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶表达是否异常的方法，该方法包括以下步骤:A、用特异性抗体或者定量PCR技术检测待检肝细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶的数量;B、将步骤A所得到的数量与正常肝细胞中D-3-磷酸甘油脱氢酶的数量进行比较， 如测得的高于正常值，则表示被检样本中D-3-磷酸甘油脱氢酶的表达异常。本专利技术提供了以D-3-磷酸甘油脱氢酶作为一个分子标志对其表达水平进行检测可以用于检测EFV肝细胞毒性。进一步的可用于制备检测EFV肝毒性的制剂或试剂盒等， 本专利技术的D-3-磷酸甘油脱氢酶与EFV肝细胞毒性的相关性将为EFV肝毒性的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。下面结合具体附图和实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些附图和实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。附图说明图1:二维凝胶电泳显示D-3-磷酸甘油脱氢酶的表达量(EFV代表未处理的肝细胞，2.5代表2.5 μ g/L的EFV处理，10代表10 μ g/L的EFV处理；圆圈所指处代表D-3-磷酸甘油脱氢酶所在的位置。图2:D-3-磷酸甘油脱氢酶的荧光定量PCR，EFV代表未处理的肝细胞，2.5代表2.5 μ g/L的EFV处理，10代表10 μ g/L的EFV 处理，GAPDH为内参对照。图3中显示了 D-3-磷酸甘油脱氢酶在EFV处理的肝细胞中有较高水平的表达。具体实施方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件参考《分子克隆实验指南》(第三版，冷泉港出版社)中所 述的条件或者制造厂商的建议条件。本专利技术以不同浓度的EFV刺激肝癌细胞系，通过检测ROS的量来监测线粒体的凋亡情况，收集未处理和2.5 μ g/L以及10 μ g/L的EFV处理I小时的肝癌细胞，裂解获得细胞蛋白质后，以蛋白质二维凝胶电泳的方法分离蛋白质，通过ImageMaster软件分析表达差异的蛋白质，并对所获得的差异蛋白质进行质谱鉴定，结果显示，D-3-磷酸甘油脱氢酶在 EFV处理的两组样品中均高表达；荧光定量PCR实验进一步证实D-3-磷酸甘油脱氢酶在 EFV处理的肝细胞中的高表达。实验结果表明，以D-3-磷酸甘油脱氢酶作为一个指标对其表达量进行检测可以用来检测EFV肝毒性，即D-3-磷酸甘油脱氢酶可作为EFV肝毒性的分子标志。实施例1制备未处理和EFV处理的肝细胞线粒体蛋白质样品本实施例中所使用的细胞培养基DMEM购自Invitrogen公司，葡聚糖T500、聚乙二醇3350、尿素、硫脲、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙横酸(CHAPS)均购自Sigma公司，EFV购自美国药典(U.S Pharmacopeia)。本实施例用不同浓度的EFV处理，于不同的时间进行ROS的检测，结果显示，ROS 的产生量与EFV成时间和浓度依赖性(如图1所示)，本实施例选定2.5 μ g/L和10 μ g/L 的EFV处理肝癌细胞(Huh7) I小时的细胞进行实验:收集细胞匀浆破碎，用双水本文档来自技高网...

【技术保护点】
D?3?磷酸甘油脱氢酶在制备肝细胞毒性分子标志物中的用途。

【技术特征摘要】
1.D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备肝细胞毒性分子标志物中的用途。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝细胞毒性分子标志物是抗艾滋病病毒药物依非韦伦肝细胞毒性预警的蛋白质分子标记或药物靶标。3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测肝细胞毒性分子标志物是检测 D-3-磷酸甘油脱氢酶蛋白在肝细胞中的表达量。4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的D-3-磷酸甘油脱氢酶蛋白在肝细胞中的表达量是检测该蛋白在肝细胞中转录是否存在上调。5.D-3-磷酸甘油脱氢酶在制备检测依非韦伦肝细胞毒性制剂中的用途，所述制剂中包括D-3-磷酸甘油脱氢酶特异性的引物和抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽军，马芳，贾小芳，周宏灏，
申请(专利权)人：中南大学，上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：