本发明专利技术公开了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因及制备方法和应用，步骤：Ａ、以水稻两周幼苗总ｃＤＮＡ为模板，设计一对特异引物，以Ｂ－Ｔａｑ为ＤＮＡ聚合酶ＰＣＲ扩增，获得水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因；Ｂ、将（Ａ）步骤获得的基因片段连接到中间载体中，并测序验证；Ｃ、将（Ｂ）步验证获得的基因片断连接到载体中，使水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因置于玉米泛素启动子和ＮＯＳ尾巴之间，形成转化；Ｄ、将制备获得的含有目的基因的过量表达载体ｐＵｂｉＯ转入农杆菌ＥＨＡ１０５，导入水稻愈伤组织中，获得水稻转基因植株。该基因在水稻中的应用。获得的该基因处于单子叶植物的强效启动子－泛素启动子的调控之下，该基因表达，不受外界环境因素的干扰，且遗传稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因植物领域，更具体涉及一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因，同 时还涉及一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法，还涉及植物三磷酸甘油醛脱氢酶 基因在水稻抗逆中的应用。
技术介绍
三石舞酸—甘油IIJKS1BI (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ；GAPDH) 是糖酵解途径中必不可少的关键酶之一，它催化D-甘油醛-3-磷酸(G-3P)可逆的氧化和 磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸(DPGA)，是维持生命活动最基本的酶之一，广泛存在与各 种生物细胞中。最近的相关研究表明，真核及原核生物的3-磷酸甘油醛脱氢酶除了在糖酵 解中起重要作用外，它在膜溶解、微管集束、磷酸转移酶活性、DNA修复、细胞凋亡、核RNA输 出、及其在细胞周期中都发挥着重要的作用。另外，GAPDH基因还具有较强的抵御环境胁迫 的能力，尤其在高温、高盐、低温等胁迫条件下，利用酵母表达技术已经证明该基因具有抗 盐、碱和高温胁迫的功能，是一种重要的抗逆境胁迫基因。该酶在植物中的研究不如在哺 乳动物中的深入，但研究已经陆续证明，3-磷酸甘油醛脱氢酶在植物中同样具有许多未被 发现的功能，目前已经报道该酶在厌氧、热激、伤害以及能量供应中可能发挥着重要作用。 目前已从众多植物中克隆出了 3—磷酸甘油醛脱氢酶基因，而单子叶禾本科植物中，大麦、 玉米、谷子、水稻的胞质3 —磷酸甘油醛脱氢酶基因也先后被克隆出来，在植物中的研究表 明，缺氧和热激都可以诱导GAPDH基因的表达，早先在烟草愈伤培养时，培养基中高浓度的 蔗糖也能使GapC类基因的表达量也有上升。植物自身的应激反应在减小机械损伤、昆虫和 病原体侵袭方面起着重要的作用，GAPDH基因在这些伤害反应中也有较高水平的表达。最 近，以拟南芥原生质体和酵母为材料的研究证明了 GAPDH基因参与了 H202调控的细胞凋 亡，在H2O2处理条件下，拟南芥GAPDH基因的表达上调，并且可以抑制由热激导致的H2O2含 量的提高和细胞死亡，本专利技术中分离出一个水稻中新的GAPDH家族成员，该基因抑制表达 转基因植株在水稻幼苗时期表现为耐盐，为水稻抗逆品系的筛选和获得提供了一种新的方 法。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因，所获得的转基因 植株遗传稳定，本实验室的过量表达载体PUbiO为高效的组成型的表达载体，可获得目的 基因高表达量的转基因植株；另外本实验室所用的转化材料中花11相对其他品种在水稻 转化的应用中也有很高的转化效率。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方 法，该方法获得的水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因的全长cDNA序列，而非全长的基因组序 列，因为真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含 有大量的重复序列，因此由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆要简单得多；另外，本方法获得的该基因处于单子叶植物的强效启动子-泛素启动子的调控之 下，使得该基因可组成型的表达，不受外界环境因素的干扰，且遗传稳定。一种能过量表达 该3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的植株，该转基因植株表现为耐盐。本专利技术的再一个目的是在于提供了一种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因在水稻抗 逆中的应用，该酶在糖酵解途径中催化D-甘油醛-3-磷酸(G-3P)可逆的氧化和磷酸化，生 成1，3-二磷酸甘油酸(DPGA)，是维持生命活动最基本的酶之一，同时，近期的研究还表明 该基因参与了植物的胁迫应答，由于糖分子也是一种重要的信号分子，所以对该基因的研 究，将对申请人理解由营养物质、生物激素和一些化学分子组成的复杂的植物信号途径以 及它们所调控的植物生长发育和逆境应答有十分重要的意义。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方法—种植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因的制备方法，该方法包括以下步骤 A、利用PCR技术，以水稻两周幼苗的总cDNA(提取两周水稻幼苗的RNA，并以此 RNA为模板，经反转录获得双链的水稻总cDNA)为模板，并根据NCBI数据库(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)提供的基因的cDNA序列(其序列为SEQID NO :3所示的核苷酸序列)， 设计一对包含了该基因全长ORF (开放阅读框)的特异引物，以B-Taq(TC)YOBA公司)为DNA 聚合酶 PCR 扩增(940C 3min，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 30cycles, 72°C IOmin)；产物电 泳并切胶回收(安比奥公司胶回收试剂盒)，从而获得包含该水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基 因的全长开放阅读框的cDNA序列(1200bp)，其序列为SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。B、将A步获得的基因片段连接到商业中间载体PBS-T II (TIANGEN公司)中(载 体图谱如图1)，测序验证，获得碱基序列完全正确的该水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因片段， 一种分离植物三磷酸甘油醛脱氢酶基因，其序列为SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。C、将B步验证获得的正确的基因片断连接到改造获得的载体PUbiO(王莹 博士毕业论文水稻胚胎发生过程中的基因表达分析，2004年)中，pUbiO载体是在 载体 pAHC17(ALAN H. CHRISTENSEN and PETER H. QUAIL. Ubiquitinpromoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenablemarker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research,1996,5 :213_218)禾口 pCAMBIA1301 (http://www. patentlens. net/daisy/bios/585. html)的基础上改造而来的， 载体pAHC17含有改造过的玉米泛素启动子及NOS尾巴，而载体pCAMBIA1300 (http://www. patentlens. net/daisy/bios/585. html)系列是目前植物转甚因中使用较多的植物表达载 体之一。一种载体PUbiO的构建步骤是首先将载体PAHC17的NOS尾巴之前引入四个多克 隆位点-BamH I,Kpn I.Sac I.Smal I。随后将改造过的pAHC17利用双酶切得到包含玉米 泛素启动子及NOS尾巴的片段，同时用相同的双酶切处理pCAMBIA1301，并与上述的片段进 行连接，从而得到含有玉米泛素启动子和NOS尾巴的可用于水稻过量表达的载体，如图2所 示，使得水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因置于玉米泛素启动子和NOS尾巴之间，形成可转化 或表达的载体； D、将制备的含有目的基因的过量表达载体pUbiO转入农杆菌EHA105 (来自中国典 型培养物保藏中心，)，导入成熟胚诱导的水稻愈伤组织中，并经过再分化最终获得过量表 达该基因的水稻转基因植株。 本专利技术中涉及的此水稻三磷酸甘油醛脱氢酶基因参与水稻幼苗期的盐胁迫反应途径。对该脱氢酶的蛋白分析(http:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的三磷酸甘油醛脱氢酶基因，其序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张秀红，饶晓兰，吕应堂，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。