无抗生素状态下产生多肽的表达系统技术方案

本发明专利技术涉及一种用于产生一种或一种以上靶多肽的表达系统，其包含宿主细胞，在所述宿主细胞的基因组中，编码３－磷酸甘油脱氢酶的ＤＮＡ序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主细胞经包含编码所述靶多肽和３－磷酸甘油脱氢酶的ＤＮＡ序列的染色体外元件转化，由此所述宿主细胞基因组与所述染色体外元件都不携带抗生素抗性基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种微生物表达系统，其在使用染色体外DNA的基础上产生多肽，由 此不必使用用于宿主细胞选择的抗生素标记基因(由所述基因得到的蛋白质使细胞具有 抗生素抗性，所述基因也称为抗生素抗性基因、抗性基因、抗生素标记或抗生素选择标记)， 而是使用编码3-磷酸甘油脱氢酶(也称为NAD (P) H依赖性二羟丙酮磷酸还原酶、NAD(P)H 依赖性3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶(NADP)、3_磷酸甘油合酶、生物合成的3-磷 酸甘油脱氢酶、L-3-磷酸甘油NAD(P)氧化还原酶)的DNA序列，因此所需多肽(例如木聚 糖酶)的产生无需添加抗生素。所述表达系统中不存在抗生素抗性基因。本专利技术还涉及一 种编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的DNA序列，以及一种具有3-磷酸甘油脱氢酶 活性的多肽。
技术介绍
现今，所需的大量多肽和酶主要是通过微生物发酵而获得。由此使用两种微生物 i)天然产生相关蛋白质的微生物；和ii)经基因修饰的微生物。现有技术中早已了解修饰 微生物所需的遗传学方法。其基本原理在于将编码相关蛋白质的基因插入宿主细胞中，并 由所述宿主细胞进行转录，翻译，可能的翻译后修饰，并且任选由个别膜分泌到周质或相邻 培养基中。随后可从个别细胞或培养上清液中分离出相关多肽。在用于产生多肽的技术方法中，首先研究用于所述产生的微生物合成和任选分 泌蛋白质的天然能力。在发酵过程中具有成本效益的系统显示出高产物形成率并且保证 将产生的多肽能够进行正确折叠、修饰等，因此主要选择所述系统作为产生多肽的系统。 确定用于此目的的微生物有真核来源的微生物，例如丝状真菌(曲霉菌(Aspergilla)、 木霉菌(Trichoderma)、青霉菌(Penicillium))和酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、 汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia))，或使用原核生物，例如大肠杆菌(E. coli)、 芽孢杆菌(bacilli)、乳杆菌(Iactobacilli)、葡萄球菌(staphylococci)、链霉菌 (streptomycetes)或假单胞菌(pseudomonades)。生物技术方法的收益性无疑取决于所获得的多肽的产率。这一产率不仅是由所用 的表达系统决定，而且还由所用的制造方法、尤其发酵参数和培养基决定。通过优化表达系 统和发酵方法，可明显增加潜力和可获得的产率。经基因修饰的微生物含有新的遗传信息，这些信息被整合到基因组中(通常见于 丝状真菌或酵母)或是整合到例如质粒等染色体外元件(通常用于原核生物或酵母)上。 新的遗传信息被整合到宿主基因组中的第一构筑体也极为稳定，没有选择压力。对于原核 生物，这种方法的缺点在于转化后，仅一个基因拷贝存在于宿主中，而且整合同一基因的 其它拷贝以便经由基因剂量效应增加产物形成率的方法相当复杂。这种方法的解决方案可 见于EP O 284 126 Bi，所述方案通过单独提供外源基因拷贝，经由对宿主细胞至关重要的 内源染色体DNA将所述拷贝整合到所述细胞的基因组中，解决了基因的稳定多次整合的问 题。专利申请案DD 277467 Al提供一种产生细胞外酶的方法，所述方法是建立在稳定、有5利地将编码相关多肽的基因多次整合到细菌染色体中的基础上。所述整合是通过在同源范 围内重组而进行。利用质粒将红霉素(erythromycine)基因插入细胞中，并在成功整合的 情况下使其失活，由此所述质粒上所含的红霉素基因可用作成功整合事件的对照。申请案WO 96/23073 Al公开一种基于转座将相关基因的数个拷贝整合到细菌染 色体中的系统，其特征在于所述载体的标记基因在整合期间或之后缺失，因此，所得菌株 无标记基因。根据这一文献，只有在构筑个别细菌菌株的过程中才需要标记。申请案WO 01/90393 Al公开一种增加整合到细菌染色体中的某些基因的拷贝数 的系统。如果使用染色体外DNA产生经基因修饰的微生物，那么应将相关基因转移到自主 复制元件(例如质粒)中，并使其以游离基因形式保持在宿主有机体中。经由每一细胞通常 较多的质粒拷贝所引起的基因剂量效应会有利地影响由相关基因编码的多肽的产率。不利 之处在于，应在完整的培养时间内保持选择压力，以便使染色体外元件在细胞中保持稳定。 在将抗生素添加到培养基中时，一般会出现这种情形。由于使微生物对抗生素产生抗性的 基因是位于染色体外元件上，故只有具有这类元件的细胞才可能生长。通过将相关基因定 位于同样会使宿主对一种或一种以上抗生素产生抗性的质粒上，来使细胞中保持所述基因 的多个拷贝。使用抗生素作为选择压力，可以避免由于分离或结构不稳定性而引起的质粒 丢失(Bron和Luxen，1985，plasmid 14, 235-244) 以这种方式，还可在细胞中稳定保持较 大质粒，并且所述细胞仍保持产生所需多肽的能力。一般说来，染色体外DNA很容易丢失， 尤其是所述有机体的未知DNA更容易丢失。对于天然含有质粒的细菌，应用选择压力通常 也是合理的，这是因为天然存在的染色体外元件通常只以低拷贝数存在；但是，工业上的高 生产率却需要高拷贝数。然而，所述高拷贝数通常只能通过选择压力来保持。近年来，使用抗生素抗性作为选择标记越来越无法令人满意。首先，使用抗生素相 当昂贵，尤其当所述抗性是基于降解抗生素的酶时更是如此，以致必须在整个培养期间供 应抗生素。其次，其在世界范围内的使用还延伸到其它的工程改造和医学领域，这使得抗性 基因散布到其它也具致病性的菌株上，从而可能会对疾病控制带来不利后果。现有技术中也已开发出无抗生素选择的系统。举例来说，Herrero等人(1990， J. Bacteriol. 172，6557-6567)发表的文章中描述作为选择标记的除草剂和重金属抗性。然 而，与反对使用抗生素的顾虑相同，也反对使用这些化合物。另一种用于使质粒在细胞中保持稳定的方法为营养缺陷型菌株(auxotrophic strain)的游离基因补充(印isomal complementation)。在这种情况下，生产菌株的基因 组中编码基本代谢功能的基因被去除或失活。因此，营养缺陷型宿主菌株只能在另外再产 生代谢功能的情况下生长。如果所述菌株能够接受所需代谢产物，或可使在宿主基因组上 失活并且编码基本功能的基因成为可用的游离基因，那么例如可将此代谢物添加到培养基 中。有利的是，这种情形发生在也携带产生多肽的相关基因的质粒上。专利EP O 284 126B1 列出用作营养缺陷型选择标记的代谢基因leu、hiS、trp等，尤其来自氨基酸合成路径的基 因。实际上，由于特别是在工业发酵培养基中，几乎所有的必需物质(例如氨基酸和 维生素)都是足量可用的，而且个别细胞可通过从培养基中吸收某一代谢物来平衡其所缺 乏的合成这一代谢物的能力，故到目前为止，很难使用所述营养缺陷型作为选择标记。6工业上使用的发酵培养基通常含有为其它过程(通常是发酵过程)的废产物的组 分，例如乙醇生产中的谷物残留物(蒸馏塔余下的谷物)、淀粉生产中的玉米残留物(玉米 浆粉或玉米浆液)或淀粉生产中的马铃薯残留物(马铃薯浆(potato slump))。这些组分 不仅能用作碳源(C)或氮源(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生一种或一种以上靶多肽的表达系统，其包含宿主细胞，在所述宿主细胞的基因组中，编码３－磷酸甘油脱氢酶的ＤＮＡ序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主细胞经包含编码所述靶多肽和３－磷酸甘油脱氢酶的ＤＮＡ序列的染色体外元件转化，由此所述宿主细胞基因组与所述染色体外元件都不携带抗生素抗性基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】DE 2007-5-4 102007021001.0一种用于产生一种或一种以上靶多肽的表达系统，其包含宿主细胞，在所述宿主细胞的基因组中，编码3 磷酸甘油脱氢酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主细胞经包含编码所述靶多肽和3 磷酸甘油脱氢酶的DNA序列的染色体外元件转化，由此所述宿主细胞基因组与所述染色体外元件都不携带抗生素抗性基因。2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述染色体外元件为质粒、噬菌体、 噬菌粒或转座子。3.根据权利要求1或2中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述染色体外元 件包含对应于编码所述宿主细胞的内源性3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列的DNA序列；编码 相关3-磷酸甘油脱氢酶或外来3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列。4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述编码3-磷 酸甘油脱氢酶的DNA序列处于弱启动子的控制下。5.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述弱启动子为位于图7中质粒pUB 110的gpsA基因的下游的启动子。6.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述弱启动子为来自枯草芽孢杆菌 (B. subtilis)的 ptsH 启动子。7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述编码所述内 源性3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列基本上精细缺失，并且不会在相邻区域引起突变或读框 移位。8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞是 源自革兰氏阳性(Gram-positive)细菌细胞。9.根据权利要求8所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞是源自葡萄球菌属 (Staphylococcus) lifM (Corynebacterium)或芽孢杆菌属(Bacillus)的细胞。10.根据权利要求9所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞是源自解淀粉芽孢杆 菌(Bacillus amyloliquefaciens)011.根据权利要求10所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞为以寄存编号 DSM18878寄存的解淀粉芽孢杆菌RH 1626。12.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞 是源自革兰氏阴性细菌细胞。13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述靶肽是选 自水解酶、果胶降解酶、蛋白水解酶或脂肪分解酶。14.一种与宿主细胞基因组互补的载体，在所述宿主细胞基因组中，编码3-磷酸甘油 脱氢酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，所述载体包含编码所述靶多肽的DNA序列， 以及编码所述3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列，由此所述载体不含抗生素抗性基因。15.根据权利要求14所述的载体，其特征在于，所述编码所述3-磷酸甘油脱氢酶的 DNA序列对应于编码所述宿主细胞中待互补的基因组的内源性3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序 列。16.一种宿主细胞，其特征在于，基因组中缺失编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列，并 且所述宿主细胞经根据权利要求14或15中任一权利要求所述的载体转化。17.一种在无抗生素情况下产生靶多肽的方法，其特征在于，根据权利要求1至12中任一权利要求所述的表达系统或根据权利要求16所述的宿主细胞是在表达所述靶多肽的条 件下生长，并分离出由此所表达的靶多肽。18.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的表达系...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯爱琳卡多特，啼娜普劳斯，璐斯史维尔德福哲，布如诺文因特，
申请(专利权)人：AB多酶两合公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]