本发明专利技术公开了一种胞内脂肪酶产生菌及其应用及筛选方法及使用方法，所述的菌株保藏编号为CCTCC?No.M2012538。本发明专利技术从富油土壤中分离得到一种胞内脂肪酶产生菌，将其用于有机相中反应高选择性合成1,3-甘油二酯，其反应的选择性高，产物的1,3-甘油二酯在甘油二酯中的含量达80%以上，不用提纯酶，可直接用于生物催化，反应过程绿色健康。
Intracellular lipase producing bacteria and their use, screening method and using method
The invention discloses an intracellular lipase producing bacterium, an application and a screening method and a method for using the same. The strain number is CCTCC, No.M2012538. The present invention obtained an intracellular lipase producing bacteria from oil rich soil, which was used for the high selective synthesis of diacylglycerol 1,3- organic phase selective reaction of high content in diacylglycerol product of 1,3- diacylglycerol reached more than 80%, without purification of enzyme, can be directly used for the biocatalytic reaction process, green health.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物科学领域，特别是一种。
技术介绍
I, 3-甘油二酯是甘油的1，3位羟基与脂肪酸相连形成的甘油二酯，它是油脂的天然成分，其口感、色泽、风味与普通甘油三酯无异，更重要的是1，3-甘油二酯在人体内的吸收代谢方式和甘油三酯及1，2-甘油二酯的不同。甘油三酯和1，2-甘油二酯均为经消化酶消化后生成单甘酯和游离脂肪酸，二者吸收进入血液后，很大部分重新合成甘油三酯。而1，3-甘油二酯经消化酶作用后生成甘油和游离脂肪酸，二者在体内转化成能量。所以食用1，3-甘油二酯可以降低内脏脂肪、抑制体重增加、减少血脂等作用，因而是理想的健康油脂。作为天然油脂的替代品，1，3-甘油二酯可以有效预防主要因肥胖而引起的多种疾病，如高血压、冠心病、脑血管疾病、糖尿病、高脂血症、高尿酸血症、胆囊炎等。而且1，3-甘油二酯还被进一步应用于含脂质食品、合成结构甘油三酯、作为医药中间体合成的原料等。所以对1，3-甘油二酯的研究受到广泛的关注。I, 3-甘油二酯虽是油脂的天然成分，但其含量很低，所以开辟新途径制备1，3-甘油二酯非常重要。合成1，3-甘油二酯的方法有化学法和生物法。用化学法获得1，3-甘油二酯，其缺点是要用到有毒有害的催化剂，对环境不友好，与人们对绿色食品的日益渴求相冲突。用生物脂肪酶法获得1，3-甘油二酯因其绿色健康，符合人们对高品质食品的日益追求，将是发展的一个趋势。而且国内还未有全细胞脂肪酶非水相合成1，3-甘油二酯的报道。产胞内脂肪酶可用做全细胞脂肪酶催化剂，可省却酶的提纯和固定化，因此可简化工艺节约成本，有利于推动其产业化应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是:提供一种，它用于脂肪酶有机相中合成1，3-甘油二酯，合成方式简单，反应的目的产物选择性高。本专利技术的是这样实现的:胞内脂肪酶产生菌，所述的菌株保藏编号为CCTCC N0.M2012538。胞内脂肪酶产生菌在高选择性合成1，3-甘油二酯的应用。胞内脂肪酶产生菌的筛选方法，先从富油土壤采样，将样品中的胞内脂肪酶产生菌经富集培养后，采用橄榄油乳化液为底物，经过富集培养后稀释涂布在固体罗丹明B选择培养基上，以微生物分解橄榄油的能力作为初筛指标，挑取具荧光圈的菌落在平板上三区划线纯化，纯化后挑取单菌落移接斜面培养基保存，从而实现初筛；之后摇瓶发酵复筛，以微生物菌体制得的酶制剂于有机相中催化1，3-甘油二酯合成的薄层结果为第一次复筛指标；再以微生物菌体制得的酶制剂于有机相中催化1，3-甘油二酯合成的高效液相检测得率为第二次复筛指标。所述的富集培养所采用的富集培养基，按重量份数计算，包括(NH4)2SO4 0.05~0.5 份，NaNO3 0.01 ~0.2 份，NaCl 0.05~0.6 份，MgSO4 0.01 ~0.2 份，K2HPO4 0.001 ~0.03份，橄榄油0.5~2份，pH为6~8。所述的固体罗丹明B选择培养基，按质量百分比浓度计算，包括葡萄糖0.2~2%，可溶性淀粉0.3~3%，蛋白胨0.1~4%，酵母浸出汁0.1~5%，K2HPO4 0.01~1%，MgSO4.7Η20 0.01 ~ 1%，NaNO3 0.1~4%及琼脂粉2%，pH为6~8 ;向上述混合溶液中加入聚乙烯醇-橄榄油乳化液9~14ml,灭菌,冷却至60°C后加入过滤除菌的浓度为I~3mg/ml罗丹明B I~4ml。胞内脂肪酶产生菌的使用方法，将菌体冷冻干燥后制得全细胞脂肪酶酶制剂，将全细胞脂肪酶酶制剂用于有机相中反应高选择性合成1，3-甘油二酯；有机相反应为甘油三酯与甘油的甘油解反应，或甘油与脂肪酸的酯合成反应。也可用于催化其它的酯合成、酯水解、酯交换等。所述的甘油解反应体系由全细胞脂肪酶酶制剂、甘油三酯、甘油、有机溶剂组成，全细胞脂肪酶酶制剂的浓度为20~60 mg/mL，甘油三酯与甘油的摩尔比为4:1~1:2，甘油三酯浓度为10~300 mmol/L，混合溶剂是正己烷与叔丁醇的混合份，正己烷与叔丁醇的摩尔比为49:1~20:1，反应温度30~50°C，转速100~250 r/min，时间12~48 h。为了验证本专利技术的技术效果，进行了如下实验: 样品的采集: 于2011年，从贵州省贵阳市白云区某榨油厂采集到样品。富集培养: 将Ig样品溶于IOmL蒸懼水中，充分摇匀，30°C，180r/min 一个小时振荡培养,颗粒沉淀后，取上层液体5mL于装有50mL液体富集培养基的250mL三角瓶中，30°C，180r/min振荡培养2天后，将富集培养基充分摇匀，取5mL转接到新的富集培养基中，进行二次富集，同样条件下振荡培养2天，进行第三次富集培养。富集培养基(质量百分比％):(NH4) 2S04 0.05 ~0.5，NaNO3 0.01 ~0.2，NaCl 0.05 ~0.6，MgSO4 0.01 ~0.2，K2HPO4 0.001 ~0.03，橄榄油 0.5 ~2。pH 6 ~8。初筛: 对经过上述培养得到的富集菌液用无菌水稀释适当倍数，取0.1mL菌液涂布于固体罗丹明B选择培养基上，30°C培养f 2天，挑取在254nm荧光灯下有荧光圈的菌落三区划线纯化，之后接种在斜面试管里保存。固体罗丹明B选择培养基(质量百分比％):葡萄糖0.2~2，可溶性淀粉0.3~3，蛋白胨 0.1 ~4，酵母浸出汁 0.1 ~5，K2HPO4 0.01 ~1，MgSO4.7H20 0.01 ~1，NaNO30.1~4，琼脂粉2，pH6~8 ;聚乙烯醇(PVA)-橄榄油乳化液9~14ml，灭菌，冷却至60°C后加入过滤除菌的浓度为I~3mg/ml罗丹明B I~4ml。橄榄油乳化液制备方法:3%聚乙烯醇:橄榄油=3:1。用打浆机混合6min成乳化液。斜面保藏培养基:真菌用PDA培养基，细菌用细菌完全培养基。第一次复筛: 以微生物菌体制得的酶制剂于有机相中催化1，3-甘油二酯合成的薄层结果为第一次复筛指标。菌体发酵: 挑取初筛的试管菌两环，加入到灭菌的富集培养基15mL/250mL培养24h，接入发酵培养基培养24tT72h，接种量为1%~2%。之后10000r/mn离心十分钟，收集菌体制成冻干粉。种子培养基(％):牛肉膏0.f 0.3;蛋白胨0.f I;葡萄糖0.f I;氯化钠0.广1。pH 6~8。发酵培养基(％):豆饼粉0.5~3 ;玉米浆0.5~3 ;可溶性淀粉0.1--2 ；K2HPO4 0.1-1 ；NaNO3 0.1- ；KC1 0.θ1-θ.1 ；MgS04 0.Ο1-Ο.1 ;橄榄油 0.5~2。pH 6~8。甘油解反应: 甘油解反应体系由全细胞冻干粉、甘油三酯、甘油、有机溶剂组成，全细胞冻干粉浓度20 mg/mL~60 mg/mL,甘油三酯与甘油的摩尔比为4:1~1:2,甘油三酯浓度:10 mmol/L~300 mmol/L，混合溶剂的比例(正己烷:叔丁醇)范围49:1~20:1，反应温度3(T50°C，转速100~250 r/min，时间 12-48 h薄层层析: 薄层板制备:1.2366g硼酸，0.15g羧甲基纤维素钠，水浴加热溶于50mL蒸馏水中。之后加入到17.5g硅胶中，调成糊状后,均匀铺于IOcmX 20cm的玻璃板上。阴干后1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胞内脂肪酶产生菌，其特征在于：所述的菌株保藏编号为CCTCC?No.?M2012538。
【技术特征摘要】
1.一种胞内脂肪酶产生菌，其特征在于:所述的菌株保藏编号为CCTCC N0.M2012538。2.一种如权利要求1所述的胞内脂肪酶产生菌在高选择性合成1，3-甘油二酯的应用。3.—种如权利要求1所述的胞内脂肪酶产生菌的筛选方法，其特征在于:先从富油土壤采样，将样品中的胞内脂肪酶产生菌经富集培养后，采用橄榄油乳化液为底物，经过富集培养后稀释涂布在固体罗丹明B选择培养基上，以微生物分解橄榄油的能力作为初筛指标，挑取具荧光圈的菌落在平板上三区划线纯化，纯化后挑取单菌落移接斜面培养基保存，从而实现初筛；之后摇瓶发酵复筛，以微生物菌体制得的酶制剂于有机相中催化1，3-甘油二酯合成的薄层结果为第一次复筛指标；再以微生物菌体制得的酶制剂于有机相中催化I,3-甘油二酯合成的高效液相检测得率为第二次复筛指标。4.根据权利要求5所述的胞内脂肪酶产生菌的筛选方法，其特征在于:所述的富集培养所采用的富集培养基，其各组分及组分的质量百分比浓度为=(NH4)2SO4 0.05~0.5%，NaNO3 0.01 ~0.2%, NaCl 0.05~0.6%, MgSO4 0.01 ~0.2%, K2HPO4 0.001 ~0.03%，橄榄油0.5 ~2%，pH 为 6 ~8。5.根据权利要求5所述的胞内脂肪酶产生菌的筛...
【专利技术属性】
技术研发人员：何腊平，周换景，王欢，李翠芹，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：
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