去除抗生素耐药性和/或使质粒稳定的方法，该方法构建的载体和转化的宿主细胞及其应用技术

本发明专利技术涉及用于除去抗生素耐药性和／或使质粒稳定的方法。本发明专利技术包括构建载体的步骤，所述载体含有为同向重复序列基因所包围的抗生素耐药性基因。此同向重复序列基因可以是一个必需基因或Ｒｅｋ－序列。在后一种情况中，载体中存在具有适宜启动子的必需基因。用所得的载体转化宿主细胞，之后去除宿主细胞中必需的染色体基因并去除细胞中载体内的抗生素耐药性基因。优选的必需基因是ｉｎｆＡ。本发明专利技术也涉及在宿主细胞内稳定维持载体的方法，在细胞中生产ＤＮＡ的方法和在细胞中生产氨基酸，肽和蛋白的方法。而且，本发明专利技术还涉及已去除染色体必需基因，并含有下述载体的转化宿主细胞，该载体含有相应的必需基因，还可能含有一或多个所需的基因Ｘ。该载体不携带抗生素耐药性基因。本发明专利技术还包括从宿主获得的载体ＤＮＡ在制备用于基因治疗的药物组合物，如疫苗中的用途。携带含有适宜基因Ｘ的载体的细菌可被用于大规模生产该基因的基因产物所针对的化合物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在宿主细胞中去除抗生素耐药性和/或使载体稳定的方法，以此作为生产载体DNA和/或重组蛋白的方法。本专利技术也包括转化的宿主细胞，其中染色体必需基因已被去除而且还包含含有此基因的载体。本专利技术还涉及根据本专利技术生产的载体DNA在制备包含缺乏任何抗生素耐药性基因的DNA的药物组合物中的用途。
技术介绍
载体的稳定维持，特别是以高拷贝数稳定维持，对于由它制备DNA并表达蛋白是重要的。包含克隆的基因并已经被引入宿主，如细菌，的克隆载体，如质粒，是很容易在细菌培养时丢失的。这是因为在细胞分裂过程中无法控制载体在子代细胞中的分配。而且，该载体对细菌宿主是一个代谢负担。失去质粒的细菌通常比携带质粒的细菌生长更好并且数目更多。无质粒分离子的累积是用于克隆和表达目的的基本复制子质粒的一个问题，因为它们不携带任何使其有序分布到子代细胞中的基因系统。这是大规模培养中在宿主细菌中维持表达质粒的一个主要的工业问题。已尝试一些方法来克服克隆质粒的分离不稳定性。i)使用一些插入载体的抗生素耐药性基因并向生长培养基中加入相应的抗生素是质粒维持的最常用选择压力。除抗生素的经济成本外，由抗生素自身和工业废物中的耐药性基因造成的潜在环境危害是明显的。因为用于质粒选择的抗生素浓度在长期培养中由于稀释和/或生长细胞的酶降解经常降低，所以至今不能完全避免无质粒分离子的出现。ii)已有人提出由协调操作的数个基因组成的天然稳定系统。应用此系统来稳定另一非必需的质粒可导致质粒体积增大(Mantile等，1999)，它会降低宿主的生长速率。这使得有可能筛选出生长较快于是在培养基中大量产生的质粒或无质粒的分离子(Weber等，1991)。质粒携带的基因中的控制功能已用来指挥具有自杀功能的染色体基因。不含质粒的细胞不具有控制功能并会被杀死，从而建立了质粒稳定性(Boe等，1987)。iii)已有人尝试对宿主细胞内编码缬氨酸-tRNA合成酶的必需基因valS进行遗传改变，来使细胞依赖于质粒所携带的相应野生型生长基因的存在而生长(Nilsson等，1987)。此方法基于下述系统，其中具有温度敏感缺陷的编码必需蛋白缬氨酸-tRNA合成酶的基因valS存在于染色体中，而正常的野生型等位基因存在于质粒中。当温度升高时，细胞只有在含有野生型等位基因的载体存在时才能生长。然而，因为染色体基因拷贝没有被去除，尽管被遗传修饰，质粒所携带的基因发生等位交换导致野生型染色体基因拷贝恢复的频率很高。因此，这些例子中的方法需要重组缺陷(recA-)的菌株，它使宿主菌株生长不利。然而，抗生素耐药性基因存在于质粒中并且不发生缺失，使工业废物具有危害性。iv)同样在一些其它情况中使质粒稳定不需要在培养时应用抗生素耐药性。例如，有人已除去必需的大肠杆菌ssb基因的染色体拷贝并将它替换到质粒中(Porter等，1990)。然而，质粒上的耐药性基因并未被去除。这些已知方法中的质粒的另一个问题是质粒的体积相当大。这是由于存在抗生素耐药性基因，并且用于建立质粒稳定性的基因构建体相当长。因而，插入任一要表达的所需基因会产生一个更大的质粒。从而存在以下风险该质粒在生长培养基中不是很稳定，并且它对于宿主细胞的生长速度有负面效应。美国专利5,972,708中描述了利用一种系统建立的质粒稳定性，该系统中质粒含有一个受染色体基因编码的抑制子控制的操纵子。该抑制子通过与此操纵子结合来被滴定(titrate)。在染色体中有细胞生长所必需的另一个基因，它受相同的抑制子控制。只要该质粒存在于细胞中，所述滴定效应会使必需的染色体基因表达。然而，如果失去了所述质粒和滴定效应，可通过抑制子遏止来关闭它。只要染色体上的耐药性基因未被去除，抗生素耐药性基因在环境中散布的风险就依然存在。专利技术简述本专利技术涉及在宿主细胞中去除抗生素耐药性和/或建立载体稳定性的方法。根据本专利技术可生产新的载体以对携带此载体的宿主细胞进行总体选择。通过除去必需基因的染色体拷贝并将它替换到质粒可获得此特性。结果是，只有携带质粒的细胞能生长，这使得宿主完全依赖于所述质粒。优选用小基因，如基因infA。所述基因infA编码的是翻译-起始因子1(IF 1)，这是细胞生存力所必需的细胞内小因子(Cummings等，1994)。该质粒不包含任何抗生素基因，因此抗生素选择是不必要的，这为培养过程提供了很多方便并消除了显著的环境忧患。该方法尤其有利于在温室和自然界中生长的转基因植物借助植物细菌中的载体实现稳定，这其中不必考虑宿主的消除。本专利技术方法可用于生产载体DNA和氨基酸，肽或蛋白，如重组蛋白。所述载体DNA可用于制备药物组合物或疫苗以用于基因治疗。它也包括转化的宿主细胞，该宿主细胞中染色体必需基因已被去除并且该细胞包含含有此基因的载体。专利技术详述根据本专利技术用于去除抗生素耐药性和/或建立质粒稳定性的方法，具有以下特征a)构建含有为同向重复序列基因所包围的抗生素耐药性基因的载体，其中同向重复序列基因可能是一个必需基因，b)当所述重复序列基因并非必需基因时，另外向载体中插入必需基因和适宜此必需基因的启动子，c)可以再插入一个多克隆位点，d)用a)，b)或c)所获得的载体转染宿主细胞，e)去除宿主细胞内的染色体必需基因，f)体内去除抗生素耐药性基因。步骤a)，b)和c)可以用任何顺序完成。由长的核酸序列组成的载体不如由较短序列组成的载体稳定。更稳定的载体可以导致获得含有所需核酸序列的载体的更多拷贝。而且，含有长的核酸序列的载体会更频繁经历能破坏载体中DNA序列结构的突变。出于此原因，必需基因应尽可能小。载体中核酸序列的总长度也依赖于可能插入所述载体中用于进行拷贝的所需DNA序列X的长度。对必需基因的选择还依赖于微生物，即载体所对应的宿主。因而不可能描述必需基因的最适长度。通常优选基因越短越好。优选必需基因是编码翻译起始因子IF1的infA。infA基因的编码序列只包含213个bp。已证明含有infA基因而没有抗细菌的耐药性基因的被测载体会保持稳定。另外，载体中还有较多位置，它们可用于插入要表达的所需基因，和/或确保载体不会变得太大从而成为宿主细胞的沉重负担因而变得不稳定。采用infA作为必需基因时，在携带载体的宿主中，必需IF1(翻译起始因子1)仅由质粒携带的infA+基因编码。因为IF1是细胞生存力所必需的细胞内蛋白(Cummings等，1994)，这使质粒在培养中高度稳定，而且无质粒分离子因为无互养效应而不能生长。采用必需基因作为选择性标记，可以使载体构建中用到的编码抗生素耐药性的基因通过两种侧翼的同向重复序列(Rek序列)之间的重组而体内去除。插入了必需基因后，就可实现这一点。一旦构建出去除了染色体必需基因并且载体中具有相同必需基因的菌株，就不需要抗生素耐药性基因了。可以用必需基因序列作为载体内抗生素耐药性基因两侧的重复序列并忽略上述方法中的步骤b)。“相同的必需基因”可被理解为与必需的染色体基因序列基本相同的基因序列被插入载体。可能存在一些不影响基因表达产物的差异，如涉及遗传密码简并性的差异，或者经过突变改变了基因产物但保留了活性的差异。当从必需基因序列以外的其它序列中选出Rek序列时，可进行下述步骤a)构建含有为同向重复序列(可以是一种基因)所本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于去除抗生素耐药性和／或使质粒稳定的方法，包括如下步骤：　　　　ａ）构建含有为同向重复序列基因所包围的抗生素耐药性基因的载体，其中所述同向重复序列基因可以是必需基因，　　　　ｂ）还可以在该载体中插入所述必需基因，适宜于该必需基因的启动子及一个多克隆位点，　　　　ｃ）用ａ）或ｂ）所得载体转染宿主细胞，　　　　ｄ）去除宿主细胞中的染色体必需基因，　　　　ｅ）体内去除抗生素耐药性基因，　　　　其中，步骤ａ）和ｂ）可以用相反的顺序完成。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：利夫艾萨克森，彼得J黑格，法黑德M阿布达尔卡里姆，
申请(专利权)人：利夫艾萨克森，彼得J黑格，法黑德M阿布达尔卡里姆，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]