本发明专利技术涉及生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及到一种多肽及其用途。本发明专利技术依据抗菌肽Cbf‑14，引入非天然氨基酸，获得对耐药性细菌具有较高抑制活性的多肽Cbf‑14‑2。本发明专利技术抗菌多肽，氨基酸序列如SEQ ID：NO：1所示。体外抗菌活性研究表明，本发明专利技术的多肽Cbf‑14‑2相对与母肽Cbf‑14对临床的耐药菌具有更显著的杀灭作用。体内菌血症模型的研究结果表明，多肽Cbf‑14‑2能够显著提升菌血症小鼠的生存率，保护菌血症小鼠的体重，降低其血液中菌浓，同时对耐药株引起的肺部组织感染炎症具有很好的治疗作用。本发明专利技术的多肽Cbf‑14‑2对哺乳动物细胞的毒性极小。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物化学中的多肽药物
，具体涉及到一种多肽及其用途，即多肽具有抗耐药性细菌感染的用途。
技术介绍
自从青霉素被发现至今，抗生素类药物一直被认为在抗感染方面有着神奇的功效，显著地提高了人类的生存质量。然而，抗生素类药物的广泛使用乃至滥用，导致了多重耐药菌的出现，给临床诊治带来了巨大的挑战。抗菌肽是机体先天免疫系统的一个关键组成部分，在自然界中普遍存在。天然存在的抗菌肽通常为较短的氨基酸序列，长度在15到40个之间。抗菌肽的表面带有正电荷，通常由天然氨基酸中精氨酸、赖氨酸以及组氨酸提供正电荷，电荷量一般为+4到+6。在亲水环境中，抗菌肽呈无规则卷曲结构，而在生物膜或模拟疏水环境下，可以形成α-螺旋，表现出显著的两亲性，即亲水基团集中在肽链的一侧，而疏水基团集中在另一侧。首先，带有正电荷的抗菌肽扩散到细菌细胞膜表面带有负电荷的区域，即脂多糖LPS、磷壁酸等酸性聚合物所在的区域。抗菌肽与细菌细胞膜通过静电作用结合后，结构由无规则卷曲转换为α-螺旋。随后，抗菌肽的亲水面与磷脂双分子层的亲水性头部集团连接，疏水面与磷脂双分子层疏水的脂肪酰基链连接，在细菌细胞膜上形成低聚膜孔。最后，细菌细胞膜形成孔状结构，胞内内容物渗出，从而导致细菌死亡。抗菌肽广谱的抗菌活性、独特的作用机制及其相对于抗生素不易产生耐药性，使其成为抗生素潜在的替代品。Cathelicidin家族，是一类N-端含有Cathelin结构域而C-端具有高度特异性的成熟肽段的抗微生物肽家族，对革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌都有较好的抑杀作用。抗菌肽Cbf-14是本实验室依据Cathelicidin家族的抗菌肽BF-30的序列经优化设计后的多肽突变体，其是由14个氨基酸组成的阳离子抗菌肽，氨基酸序列为RLLRKFFRKLKKSV，分子量1819.33.该技术记载于中国专利申请CN103435686B中(抗耐药性细菌感染多肽Cbf-14及其用途)。
技术实现思路
本专利技术依据抗菌肽Cbf-14，引入非天然氨基酸，获得对耐药性细菌具有较高抑制活性的多肽Cbf-14-2。本专利技术抗菌多肽，氨基酸序列如SEQID：NO：1所示。全序列为精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-鸟氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-鸟氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸。本专利技术的多肽可以采用固相合成法获得。本专利技术的Cbf-14-2是将Cbf-14第五位以及第九位的赖氨酸替换成与同样带一个正电荷但侧链比其少一个C原子的非天然的鸟氨酸。改造后之后的突变体所带电荷没有发生变化，但其在疏水条件下的α螺旋程度提高。体外抗菌活性研究表明，本专利技术的多肽Cbf-14-2相对与母肽Cbf-14对临床的耐药菌具有更显著的杀灭作用。所述的临床耐药菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌。体外的毒性研究表明，本专利技术的多肽Cbf-14-2对绵羊红细胞有低的溶血活性，对小鼠的脾细胞有低的毒性。即本专利技术的多肽对哺乳动物细胞的毒性极小。体内菌血症模型的研究结果表明，多肽Cbf-14-2能够显著提升菌血症小鼠的生存率，保护菌血症小鼠的体重，降低其血液中菌浓，同时对耐药株引起的肺部组织感染炎症具有很好的治疗作用。所述的耐药株为铜绿假单胞菌。下面是部分药效学试验及结果：一、本专利技术多肽Cbf-14-2对临床耐药细菌的体外抗菌活性(1)Cbf-14-2对细菌的最低抑菌浓度(MIC)①菌液的制备将实验所需的菌株从-20℃保藏的甘油管中接种至营养琼脂斜面，置于37℃培养箱中培养18h后，用接种针挑取少许接种至2ml营养肉汤培养基，置于37℃培养箱中培养8h，用MH培养基倍比稀释成105CFU/ml左右的菌悬液。②药物的配制称取适量的Cbf-14-2溶于无菌的生理盐水，将其配制成浓度为1024μg/ml的多肽母液，经0.22μM滤膜过滤除菌后分装，保存于-20℃备用。③最低抑菌浓度的测定(MIC)将用MH培养基倍比稀释成105CFU/ml左右的菌悬液，接种至96孔板中，每孔50μl。然后等体积加入经MH倍比稀释的Cbf-14-2原液，使药物终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。同时设100μl的MH培养基作为不含菌液和药物的空白对照组，设50μl菌液加入等体积的MH培养基作为只含菌液的阳性对照组。将96孔板置于37℃的恒温培养箱中培养约18h。然后，用酶标仪测定96孔板在595nm处的吸光度结果并记录，药物能够完全抑制菌液生长的最低浓度被定义为最低抑菌浓度，即MIC。结果见表1：表1Cbf-14-2对青霉素耐药菌株的MIC由表1可以看出，本试验所选用的菌株对青霉素都表现出了很强的耐药性，MIC的值均大于256μg/ml，而本专利技术的多肽对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌耐药株的MIC值只有32μg/ml。对铜绿假单胞菌标准株作用明显，MIC值可达到4μg/ml。结果证明本专利技术多肽对这些耐药菌株均表现出了很好的抗菌活性。(2)多肽Cbf-14-2对耐药细菌的最低杀菌浓度(MBC)依次将测定MIC方法中所述，96孔板中未见细菌生长的培养物分别吸取100μl加入灭过菌的平皿中，用倾倒平板法加入恒温55℃的营养琼脂培养基，充分混匀后，在细菌培养箱中倒置培养过夜。18-24h后，观察平皿上的菌落数，平皿上的菌落数小于5个的最低药物浓度，即为最低杀菌浓度(MBC)。结果见表2：表2Cbf-14-2对青霉素耐药菌株的MBC由表2可以看出青霉素在实验浓度内并没有杀死细菌，而多肽Cbf-14-2对所选实验菌株的MBC值在8-64μg/ml，说明本专利技术多肽对细菌有很好的杀灭作用。(3)多肽Cbf-14-2对耐药细菌的杀菌曲线用营养肉汤培养基将上述制备的细菌悬液重悬，调整细菌浓度为105CFU/ml左右，加入4倍MIC的Cbf-14-2，置于37℃的恒温培养箱中继续培养，在0min、10min、30min、1h、2h、4h、8h时，吸取混合培养物100μl进行系列稀释，将稀释液依次加入培养皿内并加入营养琼脂培养基混匀，每个稀释度做3个平行，置于37℃的恒温培养箱中继续培养18h后，进行活菌计数，计算平均值。然后以细菌数量的对数值为纵坐标，药物作用时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见图1、图2、图3和图4。由附图1-4可以看出，Cbf-14-2对这些临床株有很好的杀菌作用，杀菌效果迅速，4h内使得表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌下降了5个lgCFU，细菌完全被杀死。由此可见，Cbf-14-2对临床青霉素耐药的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均有较快的杀伤作用。二、本专利技术多肽Cbf-14-2对真核细胞的毒性(1)多肽对绵羊红细胞溶血的影响将新鲜的脱纤维绵羊血离心(3000rpm，10min)，弃上清，将沉淀在下层的红细胞用PBS洗涤3次，吸取0.3ml绵羊红细胞重悬于10ml的PBS中，制成体积分数为3％的绵羊红细胞悬液。将绵羊红细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔50μl，再向各孔中分别加入50μl经倍比稀释的多肽，各孔中多肽的终浓度分别为16,32,64,128,256,512μg/ml。阳性对照分别为终浓度1％TritonX-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗菌多肽，其氨基酸序列如SEQ ID：NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗菌多肽，其氨基酸序列如SEQID：NO:1所示。2.权利要求1的多肽用于制备抗耐药性细菌感染药...
【专利技术属性】
技术研发人员：周长林，刘含含，魏杉杉，康玮，窦洁，贾源宾，
申请(专利权)人：中国药科大学，南京映海月生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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