本发明专利技术提供了一种抗生素耐药ＮＤＭ－１基因的荧光检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒中特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：５′－ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＣＡ ＡＡＡ ＧＣＧ ＡＴＧ Ｔ－３′，下游引物：５′－ＣＧＧ ＣＣＡＣＡＣ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＡＡ ＴＡ－３′，荧光探针：５′－ＦＡＭ－ＴＧＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＴＣＣＣＡＡ ＣＧＧ ＴＧ－ＴＡＭＲＡ－３′，其中ＦＡＭ为荧光报告基团，ＴＡＭＲＡ为荧光淬灭基团。本发明专利技术的有益效果主要体现在：使用本发明专利技术检测试剂盒，抗生素耐药ＮＤＭ－１基因的检测敏感性高，特异性好，降低了常规ＰＣＲ扩增的假阳性率；可实现对抗生素耐药ＮＤＭ－１基因的快速、准确、特异检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
NDM-I 全称 New Delhi metallo-β -lactamase 1 (新德里金属-β -内酰胺分解 酶)，因为最初发现在印度和巴基斯坦等南亚地区，NDM-I的名称里包含它的发现地。这种 酶可分解β-内酰胺环结构，因此可使任何含β-内酰胺环结构的蛋白质失效。近期一种 可抗绝大多数抗生素的耐药性超级细菌NDM-I在英美印度等国家小规模爆发，这种细菌其 实是一种特殊的酶，它能够进入大多数细菌的DNA线粒体中存活，从而使细菌产生广泛的 耐药性。由于目前为止临床最常用的抗生素，包括青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素 类、硫霉素类、单环内酰胺类等其他非典型内酰胺类抗生素，都含有内酰胺环 结构，因此携带这种酶的细菌可以使几乎所有抗生素失效。超级细菌是指携带编写NDM-I 酶基因的细菌。大多数NDM-I超级病菌出现在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中。NDM-I基因存 在于DNA的结构中，被称为质体。研究人员称，质体可以在细菌中自由复制和移动，从而使 “超级细菌”的菌种有多种可能，具有传播和变异的惊人潜能。目前，NDM-I基因已经从南亚扩散到欧美等国家，如英国、美国、加拿大、澳大利亚、 荷兰等，全球已经报道有170多人被感染，光是英国就已经有超过50例患者；而8月14日 比利时一名男子的死亡，则成为世界上首例由它引起的死亡病例。科研工作者在印度、巴 基斯坦、英国等开展了较大范围的流行病学调查，产NDM-I肠杆菌科细菌占所监测细菌的 1.2% _13%，主要菌种为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他细菌还有阴沟肠杆菌、变形杆 菌、弗劳地枸橼酸菌、产酸克雷伯菌、摩根摩根菌、普罗威登菌等。这些细菌主要引起尿路、 血流、伤口、肺部和导管相关感染等。在美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时以及我 国香港、台湾地区等都已经有感染病例报道。
技术实现思路
本专利技术目的是根据抗生素耐药NDM-I基因设计引物和TaqMan探针，提供一种检测 抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测试剂盒及其检测方法，可实现对细菌体内携带的NDM-I 基因进行快速、准确、特异检测。本专利技术采用的技术方案是一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物 和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探 针序列如下上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘荧光探针5'-FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3'其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。本专利技术关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本 领域常规进行选择，该试剂盒可用作抗生素耐药NDM-I基因的定性检测，也可加入标准品 进行定量检测。优选的，所述试剂盒中还可包括抗生素耐药NDM-I基因标准品，所述标准品序列 如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg age ggg cca。以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标 准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样 品DNA的拷贝浓度。本专利技术还涉及一种抗生素耐药NDM-I基因的荧光检测方法，所述方法包括(1)提取待测样本DNA;(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA 聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩 增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5‘ -CAGCCACCAAAAGCGATGT-3 ‘下游引物5‘ -CGGCCACACCAGTGACAATA-3 ‘荧光探针5‘ -FAM-TGCCGTCGATCCCAACGGTG-TAMRA-3 ‘其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；所述阴性对照品可按本领域常规方法选择，通常选择不含靶基因(NDM-I)和对多 种抗生素敏感的非靶细菌，如副溶血性弧菌、志贺菌、沙门菌等。(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈值线 刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈 良好的对数增长，则判断为阳性。为达到定量检测的要求，所述方法同时以梯度浓度的标准品DNA溶液在与样品 DNA相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标、标准品 Ct值为纵坐标绘制标准曲线；根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷 贝浓度；所述标准品序列如下agc gac ttg gcc ttg ctg tcc ttg ate agg cag cca cca aaa gcgatg tcg gtg ccg tcg ate cca acg gtg ata ttg tea ctg gtg tgg ccg ggg ccg ggg taaaat acc ttg age ggg cca。所述PCR反应条件可按参照本领域常规荧光定量PCR方法，优选的，所述PCR扩增 反应条件如下95°C变性2分钟，95°C 15秒、60°C 30秒进行40个循环扩增。PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)PCR buffer终浓度为1Χ、0·3 0. 5 μ M的引物、0. 1 0. 3 μ M的荧光探针、1 2. 5U的DNA聚合酶、0. 2 0. 4mM的dNTPs， 通常取2 μ L (约50ng/ μ 1)的模板，反应总体积通常为20 50 μ L。PCR buffer终浓度 为IX，是指缓冲液中各组分终浓度与IXPCR buffer相同，通常采用市购2XPCR buffer, 体积用量为PCR反应液体系总体积的1/2。IXPCR buffer组成如下KC1 50mM, Tris-HCl IOmM, TritonX-1000. 1%, MgC12 1. 5mM。本专利技术建立了利用TaqMan荧光定量PCR技术检测抗生素耐药NDM-I基因的方法， 并经检测人工全基因合成的标本，表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR扩增技术， 使得抗生素耐药NDM-I基因的检测敏感性大大提高，而且由于荧光探针的应用，使得其特 异性亦大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率，使得我们可以在极少的标本中获得足 够的监测信息。本专利技术采用了目前较先进的特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏 感性的前提下尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR 模板的定量不论是直接PCR还是竞争性PCR，基本上都要通过PCR产物电泳，再将电泳结果 经计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗生素耐药ＮＤＭ－１基因的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、ＰＣＲ缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和ＤＮＡ聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：５′－ＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＴＧＴ－３′下游引物：５′－ＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＴＡ－３′荧光探针：５′－ＦＡＭ－ＴＧＣＣＧＴＣＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＧＴＧ－ＴＡＭＲＡ－３′其中ＦＡＭ为荧光报告基团，ＴＡＭＲＡ为荧光淬灭基团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金大智，张政，罗芸，程苏云，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。