本发明专利技术涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）的方法，属于生物技术领域。利用不对称ＰＣＲ扩增结合液相芯片技术，先在生物样品中加入定量的外源性ｍｉｃｒｏＲＮＡ，将ｍｉｃｒｏＲＮＡ进行预扩增及扩增得到扩增产物，并将修饰后的含有ｍｉｃｒｏＲＮＡ特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测ｍｉｃｒｏＲＮＡ的荧光信号与外源性ｍｉｃｒｏＲＮＡ的荧光信号的相对水平达到相对定量检测ｍｉｃｒｏＲＮＡ的目的，为ｍｉｃｒｏＲＮＡ的定量检测提供新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测核糖核酸的方法，尤其是一种检测微小核糖核酸的方法，属 于生物
技术介绍
微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链 小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发 育、组织分化、细胞调亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着 紧密的联系。最早对于microRNA表达的研究是1993年由Harvord大学Ambros课题 组报道的，他们在线虫(Caenorhabditis elegans )体内发现了源于lin_4基因的一系列 microRNA分子。随后，人们采用多种实验方法和生物信息学手段寻找microRNA分子，至今 已经在各种物种中已发现一万多种miRNA，人类已发现七百多种miRNA，随着研究的深入将 会有新的miRNA被发现，并对其中一些分子的功能进行了深入研究。然而，这些研究依赖的 一个技术关键是如何分离、检测microRNA分子。特别是各种细胞或组织microRNA表达图 谱还不清楚的时候，开发和改善检测microRNA的技术就显得尤为重要。目前常用的方法 是先将microRNA分子扩增放大，然后再通过不同的方法来检测。因为microRNA的长度 太短，与常用的PCR引物长度相当，因此用传统的扩增技术进行放大非常困难。一种比较 常用的方法是先分离小片段RNA分子，然后在每一个分子的两端各加一个连接(核酸)分 子(Adaptor)，再根据连接分子来设计引物，最后进行RT-PCR扩增为下一步检测做好准 备。检测microRNA的绝对定量或相对定量方法包括real time-PCR, Northern Blot、微 阵列芯片(Microarray)、微球等不同的技术。real time_PCR是一种基于荧光染料或MGB 探针检测microRNA的方法，该方法简单快速，但均是专利技术，使用价格昂贵；Northern Blot是一种在硝酸纤维素膜上利用同位素探针杂交检测microRNA的方法，该方法程序复 杂、耗时费力，虽然其稳定性和可靠性都比较高，但是这两种方法均不能高通量的检测多种 microRNA;而microarray技术是利用微量点样等方法，将大量基因的寡核苷酸序列有序 地固化于支持物表面，然后与待测生物样品中标记的靶分子杂交，再通过特定仪器对杂交 信号的强度进行检测、分析，从而判断样品中靶分子数量的一种技术，但该技术灵敏度不如 前两种方法，对样品起始量要求较大，一般需要1-10 μ g的RNA量，而且由于microRNA碱 基数过少，探针碱基序列的选择余地受限，不同microRNA有不同的最适宜杂交温度，即使 在相同的杂交条件下，也会引起很大程度的错配杂交，从而限制了对于相似序列microRNA 的高效识别。另外，目前microRNA的相对定量检测时常用表达水平较高的内源性microRNA 作为参考，如has-mir-16等，但研究发现这些表达水平较高的microRNA,如has-mir_16 在各生物组织中及细胞中表达差异也较大，使得microRNA的相对定量检测存在一定困难。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对以上现有技术存在的缺陷，提出一种新的4microarray技术，在微球上嫁接相应microRNA的核酸分子探针，利用流式细胞分离技 术，可以改善传统microarray的错配杂交问题，并可以同时检测近百种microRNA，达到高 通量检测的目的。本专利技术的技术原理是利用不对称PCR扩增结合液相芯片技术，先在生物样品 中加入定量的外源性mi croRNA，将mi croRNA进行扩增得到扩增产物，并将修饰后的含 有microRNA特征信息的特异性检测探针与荧光微球偶联制成液相芯片，扩增产物与液相 芯片杂交后通过液相芯片检测仪检测，通过比较待检测microRNA的荧光信号与外源性 microRNA的荧光信号的相对水平达到相对定量检测microRNA的目的。本专利技术的技术方案通过以下步骤实现步骤一、制备液相芯片，从Sanger MiRBase数据库中选取成熟的microRNA序列作为探 针序列，在所述探针序列的5’端加上C12分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编 码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片；步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的microRNA序列后8位反向互补序列的5’端 加上CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG组成反转录引物，剩余序列的5 ’端加上 ACACTCCAGCTGGG组成正向引物，并设计通用正、反向引物，在通用反向引物的5 ’端第1位及 第5位T碱基以生物素标记，在通用正向引物的第3位和第5位碱基进行锁核酸(LNA)修 饰；步骤三、在待检测的RNA中加入外源性人工合成的2种microRNA，加入量为每50 ng 待测RNA各加5 fmol ；步骤四、对待测样品RNA进行反转录反应，得到合成的cDNA ； 步骤五、对所述cDNA进行预扩增反应，得到预扩增产物；步骤六、对所述预扩增产物进行不对称PCR扩增反应，得到待测样品的PCR扩增产物； 步骤七、将所述待测样品的PCR扩增产物与特异性检测微球杂交，得到杂交反应产物； 步骤八、将所述杂交反应产物离心弃上清后，与链霉菌抗生物素蛋白-藻红蛋白反应， 得到反应产物；步骤九、用液相芯片检测仪对步骤八中的反应产物进行检测，得到检测结果。本专利技术的技术方案通过以下步骤进一步实现步骤一中偶联的体积为25 μ 1，每IX IO6个荧光微球对应的特异性检测探针加入量为 0. 04 0. 1 nmol。步骤二中所述通用反向引物序列为TGGTGTCGTGGAGTCG，所述通用正向引物序列为 ACACTCCAGCTGGG。步骤三中所述外源性人工合成mi croRNA的序列为CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CA⑶CAG， GACCUCCAUGUAAACGUACAA。步骤四中反转录反应体系为 10X Reverse Transcription Buffer 2 μ 1， 25XdNTPs 0. 8 μ 1， 50 U/μ L 白勺 MultiScribe Reverse Transcriptase 1 μ 1, RNAase 抑制剂1 U，所述反转录引物5 nM, RNA 50 ng，补水至20 μ ，反应条件为16°C 30 min, 60 个循环的20°C 30 s, 42°C 30 s,50°C 1 s，最后85°C，5 min灭活反转录酶，得到合成的 cDNA。步骤五中反应体系为Multiplex PCR master mix 12.5 μ 1，正向引物各50 nM,5通用反向引物0.2 μΜ,步骤四中合成的CDNA2 μ ，补充水至25 μ ，反应条件为95°C 15min，18 个循环的 94°C 15s，60°C 5s, 55°C 15s，72°C 15s，最后 72°C 2min。步骤六中反应体系为Multiplex PCR master mix 10 μ 1，通用正向引物各0. 1 μ Μ，通用反向引物1 μΜ，以水1 :400稀释步骤五中的预扩本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于液相芯片检测微小核糖核酸的方法，包括以下步骤： 步骤一、制备液相芯片，从Ｓａｎｇｅｒ ＭｉＲＢａｓｅ数据库中选取成熟的ｍｉｃｒｏＲＮＡ序列作为探针序列，在所述探针序列的５’端加上Ｃ１２ 分子臂和氨基修饰，并将修饰后的探针与不同编码的荧光微球偶联，得到特异性检测微球，即液相芯片； 步骤二、设计引物和探针，在所述成熟的ｍｉｃｒｏＲＮＡ序列后８位反向互补序列的５’端加上ＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧ组成反转录引物，剩余序列的５’端加上ＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＧ组成正向引物；并设计通用正、反向引物，在通用反向引物５’端第１位及第５位Ｔ碱基以生物素标记，在通用正向引物的第３位和第５位碱基进行锁核酸修饰； 步骤三、在待检测的ＲＮＡ中加入外源性人工合成的２种ｍｉｃｒｏＲＮＡ ，加入量为每５０ ｎｇ待测ＲＮＡ各加５ ｆｍｏｌ； 步骤四、对待测样品ＲＮＡ进行反转录反应，得到合成的ｃＤＮＡ； 步骤五、对所述ｃＤＮＡ进行预扩增反应，得到预扩增产物； 步骤六、对所述预扩增产物进行不对称ＰＣＲ扩增反应，得到待测样品的ＰＣＲ扩增产物； 步骤七、将所述待测样品的ＰＣＲ扩增产物与特异性检测微球杂交，得到杂交反应产物； 步骤八、将所述杂交反应产物离心弃上清后，与链霉菌抗生物素蛋白－藻红蛋白反应，得到反应产物； 步骤九、用液相芯片检测仪对步骤八中的反应产物进行检测，得到检测结果。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔仑标，葛以跃，史智扬，戚宇华，赵康辰，单云峰，周明浩，汪华，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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