本发明专利技术属表观遗传学领域，涉及肿瘤的基因诊断，具体涉及ＡＫＡＰ１２基因启动子区域的甲基化，尤其对人ＡＫＡＰ１２基因甲基化程度的检测。本发明专利技术提供了一种定量检测ＡＫＡＰ１２甲基化水平的方法，分别以样品和标准品的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然后根据每个标准品其差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比较获得样品ＡＫＡＰ１２甲基化百分比。本方法能检测低至１％的甲基化发生，且重复性高、简便易行，特别是对无法作组织取样的肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监控，可以作为肿瘤，尤其是结直肠癌的辅助诊断、监测和治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属表观遗传学领域，涉及肿瘤的基因诊断，具体涉及AKAP12基因启动 子区域的甲基化，尤其对人AKAP12基因甲基化程度的检测。
技术介绍
DNA甲基化是指由DNA甲基转移酶催化S_腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在胞 嘧啶碱基上的第5位碳原子上增加一个甲基，使其转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反 应。发生在肿瘤中的甲基化现象，最主要的特点是全基因组的低甲基化和局部位点的高 甲基化并存，例如启动子区域的CpG岛。这一现象既被认为是肿瘤抑癌基因失活的机制 之一，也是肿瘤良恶性转化的重要判别标志。由于抑癌基因发生改变往往要早于细胞的 恶性增生，因此检测抑癌基因的状态可以用于肿瘤发生的早期预测。以往的一些研究表明在肿瘤组织、外周血(血浆/血清)、肿瘤累及器官相关的 体液(如唾液、痰等)中均可以发现肿瘤相关的甲基化DNA，癌变细胞可以释放DNA到 外周血或者体液中，因而可以检测到肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。一项对肺癌患 者血清中游离循环DNA的检测发现，大多数的肺癌患者血清中都存在一些基因启动子区 高甲基化的现象(文献1)。同样Valenzuela等也发现在膀胱癌患者血清中和基因启动子 异常甲基化高度相关(文献2)。外周血中高水平的游离DNA，特别DNA的高甲基化现 象，常常与肿瘤的发生、发展、对治疗的反应性以及预后等都密切相关，因而可能将高 甲基化作为肿瘤筛查、早期诊断、监测转移，预后复发的标记物，并能有助于早期发现 有癌变倾向的细胞(文献3-5)。检测外周血中抑癌基因甲基化水平，作为肿瘤的标记物具有很大潜力，因为甲 基化分子标记物拥有以下明显的优势1，通常甲基化会以“多发”的形式发生在一种 肿瘤中，因此，挑选一些位点进行检测就能反映全部基因的状态。2，高甲基化通常发生 在相同的基因区域，所以容易锁定目标。3，高甲基化发生在DNA水平，可以避免检测 RNA或者免疫组化带来的其他因素的干扰。4，异常的结果是一个阳性的信号，能减少 正常细胞的污染带来的困扰(文献6)。如Ellinger J等监测了膀胱癌患者血清中APC， DAPK, GSTPl, PTGS2, TIGl 和 Reprimo 的甲基化 DNA，发现三个基因(APC，GSTPl andTIG1)的甲基化有助于膀胱癌的诊断和预后，对膀胱癌具有潜在的诊断价值。A激酶锚定蛋白12(AKAP12/AKAP250/Gravin)位于6q24-q25，主要分布为细 胞质中。最初是从重症肌无力的患者血清中得到的(文献7)，属于细胞特异性的AKAP。 AKAP12主要参与PKA和PKC复合物的形成(文献8)，同时亦是一重要的β 2肾上腺 素受体复合物的调节基因(文献9)，并参与了蛋白定向、信号转导以及G蛋白偶联受体 蛋白信号转导途径。最近的一些研究显示，ΑΚΑΡ12基因除了在多条信号通路中扮演重 要的角色之外，还在多种肿瘤中缺失，例如黑素瘤(文献10)、乳腺癌(文献11)、前列 腺癌(文献12)、胃癌(文献13)以及慢性淋巴细胞性白血病(文献14)等。同时Choi 等人(文献13)在胃癌研究中首先报导了将异常的DNA甲基化与ΑΚΑΡ12表达缺失相对应。提示这可能是一个重要的肿瘤生长的负调节基因，这个基因可能是一个潜在的治疗 基因，也有可能是一个有用的肿瘤生物标志物(文献13)。参考文献l.Pan H，Califano J，Ponte JF，et al.Loss of heterozygosity patternsprovide fingerprints for genetic heterogeneity in multistep cancer progression oftobacco smoke-induced non-small cell lung cancer.Cancer Res 2005 ； 65 1664—9.2.Valenzuela MT，Galisteo R，Zuluaga A，et al.Assessing the use ofpl6 (INK4a) promoter gene methylation in serum for detection of bladder cancer.EurUrol 2002 ； 42 622—8.3.Esteller M，Fraga MF，Paz MF，et al.Cancer epigenetics and methylation.Science 2002 ； 297 1807-8.4.Zhong XY, Ladewig A，Schmid S，et al.Elevated level of cell-freeplasma DNA is associated with breast cancer.Arch Gynecol Obstet 2007 ； 276 327-31. 5.Ellinger J，Haan K，Heukamp LC，et al.CpG island hypermethylation incell-free seram DNA identifies patients with localized prostate cancer.Prostate2008 ； 68 42-9.6.Yates DR，Rehman I，Abbod MF，et al.Promoter hypermethyIationidentifies progression risk in bladder cancer.Clin Cancer Res 2007 ； 13 2046-53.7.Gordon T， Grove B， Loftus JC， et al.Molecular cloning and preliminarycharacterization of a novel cytoplasmic antigen recognized by myasthenia gravis sera. J Clin Invest 1992 ； 90 992-9.8.Nauert JB，Klauck TM，Langeberg LK，Scott JD.Gravin，an autoantigenrecognized by serum from myasthenia gravis patients， is a kinase scaffold protein. CurrBiol 1997 ； 7 52-62.9.Shih M，Lin F，Scott JD，et al.Dynamic complexes of beta2-adrenergicreceptors with protein kinases and phosphatases and the role of gravin.J Biol Cheml999 ； 274 1588-95.10.Millikin D，Meese E，Vogelstein B，et al.Loss of heterozygosity forloci on the long arm of chromosome 6 in human malignant melanoma.Cancer R本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量检测ＡＫＡＰ１２甲基化水平的方法，其特征在于，对样品ＤＮＡ进行修饰后，分别以样品和标准品的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，进行高分辨率熔解曲线分析，然后根据每个标准品差异显示的荧光强度建立标准曲线，最后将样品与标准品的曲线比较获得样品ＡＫＡＰ１２甲基化百分比。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘维薇，关明，吕元，李敏，刘春芳，林勇，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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