检测人前列腺癌中１７β一羟基类固醇脱氢酶７表达量的试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种检测人前列腺癌样本中１７β一羟基类固醇脱氢酶７（１７β－ＨＳＤ７）ｍＲＮＡ表达量的实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒。本试剂盒含有２×逆转录反应液，２０×逆转录酶，焦碳酸乙二酯处理的水，２×聚合酶链反应液，２０×检测用引物、荧光探针，标准品。本发明专利技术建立了利用Ｔａｑｍａｎ技术检测１７β－ＨＳＤ７表达的方法，并经检测实践表明，本发明专利技术试剂盒及检测方法切实可行。由于本方法采用了ＰＣＲ扩增技术，使得１７β－ＨＳＤ７表达的检测敏感性大大提高，可以在极少的标本中获得足够的信息，由于荧光探针的应用使得特异性也大大提高，降低了常规ＰＣＲ扩增的假阳性率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种检测人前列腺癌样本中 17 13 —羟基类固醇脱氢酶7 (17 13 -HSD7)mRNA表达量的实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一。根据资料显示，前列腺癌发病率和病死率存在明显的地区差异，美国、北欧、西欧和澳洲是前列腺癌的高发地区，而亚洲和北非是相对低发地区。但前列腺癌低发地区从20世纪70年代起发病率也有大幅度上升的趋势.。过去，我国前列腺癌发病率较低，但随着人均寿命的延长、膳食结构的改变及诊断技术的进步，其发病率在逐年提高，已跃居为男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第三位。 临床目前的诊断技术主要有前列腺的肿瘤标志物、直肠指检(DRE)、影像学检查和前列腺穿剌活检等。目前前列腺特异性抗原(PSA)作为一种无创简便的检测手段已被广泛应用于前列腺癌的诊治。然而一个理想的前列腺癌肿瘤标志物应具有前列腺特异性、能够早期诊断肿瘤并能够同良性前列腺增生症相鉴别、便于检测和随访等特点。显然这些并不是PSA就能够全部满足的，因此，寻找更多的肿瘤标志物，对于前列腺癌的早期诊断和治疗有重要意义。 人17P-羟基类固醇脱氢酶(17P-HSD7)是一个膜相关还原酶，它是催化低生 物活性的雌酮生成为与高生物活性的雌二醇的关键酶之一，并能转化双氢睾酮为5 a -雄 烷-3 13 ， 17 13 - 二元醇，其催化还原的部位为底物17位点或3位点的酮基团。17 13 -HSD7对 黄体酮和20a —羟基孕酮次要的3 13 -HSD样活性也被检测到。人17 P -HSD7存在于生成类 固醇的组织和一些周缘组织，象肝、肺和胸腺，除了性激素外17P-HSD7也有其它的底物， 在胆固醇的生物合成中，17 13 -HSD7起酮类固醇还原酶作用。将酵母甾酮转化为酵母甾醇。 17 13 -HSD7作为性激素代谢的关键酶之一与前列腺癌的发生与发展有着密切的关 系，其表达量在在前列腺癌的病程中呈现规律的变化，因此检测17P-HSD7的表达量对于 前列腺癌的早期诊断，治疗，预后评估都有着潜在的价值。 传统的基因检测技术主要运用聚合酶链反应(PCR)或逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)的方法大量扩增待测基因，然后通过溴化乙锭染色和琼脂糖凝胶电泳定量待测基 因。以上方法有着极高的高灵敏度，但基于PCR反应的特点，反应终点的产物量往往无法正 确反映反应初始阶段DNA的含量，因此定量不够精确，同时其检测的分辨率也不高，DNA的 量的差异如果低于五倍，往往检测不出。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测人前列腺癌样本中1713 —羟基类固醇脱氢酶 7 (17 P -HSD7)mRNA表达量的实时荧光定量PCR试剂盒。 本专利技术的试剂盒包含2X逆转录反应液，20X逆转录酶，DEPC-H20，2XPCR反应液，20X检测用引物、荧光探针，标准品。其中2X逆转录反应液含有RT缓冲液、DEPC-H20、 Oligo (dT) 、 dNTPs、 Rnasin。 其中2XPCR反应含有PCR缓冲液，MgCl2， dNTPs， Taq酶。 所述的检测用引物包括 17 P -HSD7上游引物序列5' -GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3' 17 P -HSD7下游引物序列5' -CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3'GAPDH上游引物序列5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'GAPDH下游引物序列5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' 所述的荧光探针包括 17 P -HSD7荧光探针5' -FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3'GAPDH荧光探针5' -FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3' 本专利技术中，2X逆转录反应液，2XPCR反应液，DEPC-H20保存于4t:; 20X逆转录酶，20X检测用引物、荧光探针保存于_20°C。 标准品为人前列腺癌细胞系LNCaP的cDNA。 本专利技术试剂盒具有如下特点 近年来不断完善的实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号的积累监控整个PCR的进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA精确定量。由于只对指数期反应的产物进行检测和荧光基团的信号放大作用，它克服了传统PCR的定量不精确，分辨率低的缺点。 本专利技术建立了利用T叫man技术检测17 P -HSD7表达的方法，并经检测患者表明该方法切实可行。由于本方法采用了 PCR扩增技术，使得17 13 -HSD7表达的检测敏感性大大提高，使得临床实践中可以在极少的标本中获得足够的信息，而且由于荧光探针的应用使得特异性也大大提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率。 本方法所设计的引物、探针以及检测结果可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。 在本专利技术中，采用了目前特异性最高的的荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下能尽量减少假阳性干扰。在实时荧光定量PCR检测技术出现之前，人们对PCR模板的无法精确定量，都是通过PCR产物电泳，再将电泳结果进行计算机图像处理，根据电泳条带的亮度来确定最终PCR产物的量，即使PCR条件以最优化，电泳及后续步骤的操作的不稳定因素仍会给结果分析带来影响。实时荧光定量PCR技术的出现，临床检验中可以真正地做到对PCR模板的精确定量，这种定量不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性大大提高。 本专利技术试剂盒使用方法如下 每次检测应设立阳性和阴性对照。标准品可做阳性对照，也可使用自行制备的前列腺癌DNA样本，阴性对照用DEPC-H20即可。 逆转录总体积20 ii l，其中2 ii 1待测RNA， 10 iU 2X逆转录反应液，1 yl 20 X逆转录酶，7ii 1 DEPC-H20。 25°C 10分钟，37。C 120分钟。 扩增在荧光定量PCR以上进行，总体积为lOiU，其中2iU检测样品，5iU2XPCR反应液，0. 5iU 20X检测用引物、荧光探针，2. 5iU DEPC-H20。反应条件95。C 104分钟变性，95t: 15秒、60。C 1分钟进行40个循环。附图说明 图1是HSD17B7标准曲线。 图2是GAPDH标准曲线。具体实施例方式本专利技术结合具体实施例做进一步说明。应理解，实施例仅用于说明目的，而不用于限制本专利技术范围。 实施例1 荧光定量RT-PCR检测人前列腺癌样本中17 P -HSD7的表达量 —、实验材料 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；匪LV逆转录酶，Taq DNA聚合酶，OligodT购自美国Promega公司；7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。 二、引物及探针设计与合成 以17 P -HSD7，GAPDH全长cDNA序列为模板，使用Primer Express 2. 0软件分析T叫Man引物和探针位点，选取最佳组合。 检测用引物 17 P -HSD7上游引物序列5' -GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3' 17 P -HSD7下游引物序列5' -CATGTTCCTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测人前列腺癌中１７β一羟基类固醇脱氢酶７表达量的试剂盒，其特征是所述的试剂盒含有：２×逆转录反应液，２０×逆转录酶，焦碳酸乙二酯处理的水，２×聚合酶链反应液，２０×检测用引物、荧光探针，标准品，其特征是：２×逆转录反应液含有逆转录缓冲液、焦碳酸乙二酯处理的水、寡聚（ｄＴ）、ｄＮＴＰｓ、ＲＮＡ酶抑制剂，２×聚合酶链反应液含有聚合酶链缓冲液、耐热ＤＮＡ聚合酶，ＭｇＣｌ↓［２］，ｄＮＴＰｓ。

【技术特征摘要】
检测人前列腺癌中17β一羟基类固醇脱氢酶7表达量的试剂盒，其特征是所述的试剂盒含有2×逆转录反应液，20×逆转录酶，焦碳酸乙二酯处理的水，2×聚合酶链反应液，20×检测用引物、荧光探针，标准品，其特征是2×逆转录反应液含有逆转录缓冲液、焦碳酸乙二酯处理的水、寡聚(dT)、dNTPs、RNA酶抑制剂，2×聚合酶链反应液含有聚合酶链缓冲液、耐热DNA聚合酶，MgCl2，dNTPs。2. 根据权利要求l所述的检测人前列腺癌中1713 —羟基类固醇脱氢酶7表达量的试 剂盒，其特征是，所述的20X检测用引物、荧光探针含有1713 —羟基类固醇脱氢酶7上游 引物、下游引物、荧光探针，3-磷酸甘油醛脱氢酶上游引物、下游引物、荧光探针，其中1713 —羟基类固醇脱氢酶上游引物序列为5' -GCGAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜梅，李瑶，谢毅，毛裕民，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]