引物组、试剂盒以及同时检测单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法技术

本发明专利技术提出了一组引物组。根据本发明专利技术实施例的引物组能够高效特异性地同时检测NR‑21、NR‑24、NR‑27、BAT‑25、BAT‑26和MONO‑27单态性单核苷酸重复位点的微卫星不稳定，检测结果峰值稳定且分布合理，无杂峰。

【技术实现步骤摘要】
引物组、试剂盒以及同时检测单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及引物组、试剂盒以及同时检测NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27单态性单核苷酸重复位点微卫星不稳定的方法。
技术介绍
微卫星(Microsatellite)DNA是广泛分布于原核和真核生物基因组中短的串联重复序列，约占人类基因的10％，核心序列为1～6bp。这类基因多位于基因非编码区及染色体的近端粒区，在人群中表现为高度多态性主要是由于重复序列长度的数目不同，正常个体体细胞在生长发育过程中其长度(或重复序列的重复次数)保持不变。经统计学计算，微卫星的自发突变率为104～105。微卫星DNA具有较高的遗传稳定性，呈孟德尔共显性遗传。体细胞的MSI首先在研究结肠癌组织的研究中发现：在大部分患者特别是遗传性非息肉性结肠癌(HNPCC)患者的肿瘤细胞中广泛存在DNA重复序列长度的改变(即MSI)，其重复序列长度越长，突变频率越高。产生MSI的原因主要是DNA复制过程中滑动或修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失，由于重复拷贝数发生大的变化而使某些重要功能的基因发生功能改变，其中涉及到的重要基因是错配修复基因(如hMHL1，hMSH2，hMSH6等)。这类基因表达产物的功能是纠正因环境因素所致的DNA复制过程出现的错误，确保复制过程的“保真性”。当发生MSI时修复能力即大大减弱，甚至失去活性。如果MSI发生于控制生长和增殖的基因(如BAX和TGFB)，将导致肿瘤的发生。细胞DNA错配修复系统基因突变，使得在DNA复制过程中出现的错误无法得到纠正，导致基因突变率升高，微卫星序列和其他序列突变的累积致使MSI的发生，同时也一步步迈向恶性变的过程，最终形成MSI型结肠癌。错配修复系统功能丧失是MSI型结肠癌形成过程中的早期分子生物学事件。MSI分为三类：①高频微卫星不稳定(High-frequencymicrosatelliteinstability，MSI-H)：2个或2个以上微卫星位点不稳定(或检测的大板标记中>30％的位点不稳定)。②低频微卫星不稳定(Low-frequencymicrosatelliteinstability，MSI-L)：只有1个微卫星位点不稳定(10％～30％标记位点不稳定)。③微卫星稳定(Microsatellitestability，MSS)：无不稳定微卫星位点(<10％标记点不稳定)。1998年，美国国立癌症研究院协作组推荐2个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26)和3个双核苷酸位点(D2S123、D5S346、D17S250)作为MSI检测的标记点，但由于双核苷酸位点具有多态性，在群体中重复单位的数目表现杂合性，为了提高MSI检测的准确性，故推荐病理学家从肿瘤组织周围的正常组织或者抽血提取DNA与肿瘤组织配对进行MSI检测。2004年，新的专家共识意见中推荐5个准单态性的单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27)作为MSI检测的标记点。其原因是研究发现单核苷酸标记位点在大部分个体的等位基因中重复单位的数目是相同且恒定，故单核苷酸标记位点可被看作准单态性。因此，采用单核苷酸标记位点进行MSI检测，无需对肿瘤组织配对正常组织的DNA进行MSI检测，不但可以提高MSI检测的敏感性，而且降低成本和时间损耗。自此，寻找新的准单态性的单核苷酸位点成为研究的热点。2005年有学者不但发现了新的准单态性的单核苷酸位点CAT25，而且研究表明仅采用3个单核苷酸位点(BAT-25、BAT-26、CAT-25)检测的敏感性和特异性可以与之前美国国立癌症研究院协作组推荐的2个单核苷酸位点和3个双核苷酸位点的方法等同。2012年又有学者发现了新的单核苷酸位点MT1XT20，初步的研究表明其具有不错的敏感性和特异性。MSI在临床病理学具有重大意义，随着对MSI与肿瘤关系研究的深入，表明很多肿瘤的发生与MSI相关，MSI是继癌基因、抑癌基因发现之后的又一肿瘤发生的新途径，在肿瘤预防、诊断和治疗上有重大意义，MSI在肺癌、食管癌、膀胱癌早期诊断方面具有很高的特异性。研究基因组MSI的发生也有助于发现新的抑癌基因(易感基因或疾病基因)。PCR是判定MSI型肿瘤的“金指标”，利用免疫组织化学检测MSI-H，虽可能由于错配修复基因突变、蛋白产物表达但是其产物功能减弱甚至丧失的极少数病例出现假阳性而漏检，但是利用单克隆抗体筛查hMLH1、hMSH2蛋白，对MSI-H的判定仍具有很高的特异性和准确性。有文献报道：同时用PCR检测MSI与利用抗hMLH1、抗hMSH2单克隆抗体检测1144份结肠癌标本，其中350例(30.6％)被检测为MSI-H的免疫组织化学显示其中323例表现为hMLHI(70.6％)或hMSH2(29.4％)，敏感性达92.3％、特异性为100％，仅有3.3％的MSI-H病例表达上述基因蛋白。与PCR技术相比有快速、灵敏、成本低等优势，故适宜用于HNPCC的家系分析和大规模的流行病学调查。肿瘤的预后与肿瘤的早期发现与肿瘤的早期治疗密切相关，寻找特异的肿瘤分子标记如MSI的研究，对临床用药、预后等方面都具有指导意义。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识做出的：专利技术人发现，如果待测样本能够同时检测出6个单态性单核苷酸重复位点，包括NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26和MONO-27中的至少两个具有微卫星不稳定，那么该待测样本的细胞被施加PD-1单抗后，其复制会被高效抑制或被特异性杀伤；如果该待测样本来源于癌症患者，那么患者给予PD-1单抗治疗后，其患者进行PD-1单抗免疫治疗的效果更好，五年存活率更高。基于上述发现，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一组引物组。根据本专利技术的实施例，所述引物组包括下列6对引物：第一对引物：具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的第一正向引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的第一反向引物；第二对引物：具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的第二正向引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的第二反向引物；第三对引物：具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的第三正向引物和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的第三反向引物；第四对引物：具有SEQIDNO:7所示核苷酸序列的第四正向引物和具有SEQIDNO:8所示核苷酸序列的第四反向引物；第五对引物：具有SEQIDNO:9所示核苷酸序列的第五正向引物和具有SEQIDNO:10所示核苷酸序列的第五反向引物；第六对引物：具有SEQIDNO:11所示核苷酸序列的第六正向引物和具有SEQIDNO:12所示核苷酸序列的第六反向引物。GAGTCGCTGGCACAGTTCTA(SEQIDNO:1)。CTGGTCACTCGCGTTTACAA(SEQIDNO:2)。TTGCTGAATTTTACCTCCTGAC(SEQIDNO:3)。ATTGTGCCATTGCATTCCAA(SEQIDNO:4)。CCATGCTTGCAAACCACT(SEQIDNO:5)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组引物组，其特征在于，包括下列6对引物：第一对引物：具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第一正向引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第一反向引物；第二对引物：具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的第二正向引物和具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的第二反向引物；第三对引物：具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的第三正向引物和具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的第三反向引物；第四对引物：具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的第四正向引物和具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的第四反向引物；第五对引物：具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的第五正向引物和具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的第五反向引物；第六对引物：具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的第六正向引物和具有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的第六反向引物。

【技术特征摘要】
1.一组引物组，其特征在于，包括下列6对引物：第一对引物：具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的第一正向引物和具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的第一反向引物；第二对引物：具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的第二正向引物和具有SEQIDNO:4所示核苷酸序列的第二反向引物；第三对引物：具有SEQIDNO:5所示核苷酸序列的第三正向引物和具有SEQIDNO:6所示核苷酸序列的第三反向引物；第四对引物：具有SEQIDNO:7所示核苷酸序列的第四正向引物和具有SEQIDNO:8所示核苷酸序列的第四反向引物；第五对引物：具有SEQIDNO:9所示核苷酸序列的第五正向引物和具有SEQIDNO:10所示核苷酸序列的第五反向引物；第六对引物：具有SEQIDNO:11所示核苷酸序列的第六正向引物和具有SEQIDNO:12所示核苷酸序列的第六反向引物。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，进一步包括下列3对引物：第七对引物：具有SEQIDNO:13所示核苷酸序列的第七正向引物和具有SEQIDNO:14所示核苷酸序列的第七反向引物；第八对引物：具有SEQIDNO:15所示核苷酸序列的第八正向引物和具有SEQIDNO:16所示核苷酸序列的第八反向引物；第九对引物：具有SEQIDNO:17所示核苷酸序列的第九正向引物和具有SEQIDNO:18所示核苷酸序列的第九反向引物。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物组的5’端具有荧光素标记。4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述第三、第四、第五对引物的5’端标记FAM，所述第一、第二和第七对引物的5’端标记HEX，所述第六、第八、第九对引物的5’端标记TAMRAD...

【专利技术属性】
技术研发人员：李长平，董超，王秀莉，郭琦，卢孟孟，宋廷瑞，
申请(专利权)人：北京莲和医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11