一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF及其筛选方法，属于生物技术领域。本发明专利技术利用高通量测序技术对达氏鲟进行雌雄转录组比较测序，对转录组数据进行组装、注释及差异基因的表达分析。利用FPKM法分析雌雄性腺中基因表达水平。使用EBSeq进行基因的差异表达分析，获得雌雄两个样品之间的差异表达基因集。在筛选过程中，选用FDR作为差异表达基因筛选的关键指标，将FDR小于0.05且差异倍数大于等于2作为筛选标准。随后对差异基因进行功能注释，筛选出其中同性别决定相关的基因，为今后达氏鲟性别鉴定，性别决定基因及性别决定机制的研究提供依据。

【技术实现步骤摘要】
一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF及其筛选方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF及其筛选方法。
技术介绍
鱼类性别相关信息的获得，无论是对其种群资源的保护还是对增养殖都是极其重要的。然而，许多鱼类没有显明的外部性征，尤其是在非繁殖季节，这对于雌雄的鉴别及性腺发育阶段的区分带来了极大的困难。鲟鱼是现有鱼类中最古老的一种鱼类，迄今已有2亿多年的历史，素有“水中活化石”之称。目前，一方面由于过度捕捞、污染及栖息地环境退化等原因致使全世界范围内野生鲟鱼的数量急剧下降，大多数已被列为濒危物种。另一方面，人们对鲟鱼肉制品及鱼籽酱需求的日益增长，发展鲟鱼的人工养殖业将变得十分重要。但是，鲟鱼没有第二性征，外部特征不足以进行性别鉴别，而且鲟鱼性成熟时间较长，性成熟年龄一般都在5龄以上。这对于野生鲟鱼资源的保护、增殖及其人工养殖业的发展带来了极大的困难。因此，性别鉴别成为鲟鱼野生资源保护及人工养殖过程中的热点和焦点问题。一般来讲，获得鲟鱼性别相关信息通常是进行解剖，取出性腺进行观察或者组织切片鉴定，这样既浪费时间而且其准确性受到个体大小及性腺发育阶段的影响。基因标记具有操作简单、对环境依赖小、成本低等优点。由于鲟鱼类的特殊进化地位及其稀少的种质资源，使其性别研究相对困难，通过高通量转录组测序对达氏鲟进行性别决定基因的研究将为鲟鱼性别决定机制的探索提供重要的参考价值。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF及其筛选方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还公开了一种上述的达氏鲟性腺差异表达基因GSDF在达氏鲟性别鉴定、性别决定基因及性别决定机制中的应用。本专利技术还公开了一种上述的达氏鲟性腺差异表达基因GSDF的筛选方法，包括以下步骤：(1)达氏鲟cDNA文库的构建：用TRIzol试剂盒提取达氏鲟组织RNA，构建达氏鲟转录组文库；(2)测序数据质量控制：高通量测序得到的原始图像数据经IlluminaCasava碱基识别软件分析转化为原始测序(Rawreads)序列，随后对Rawdata进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量Reads获得高质量的Cleandata；(3)组装：原始测序序列经过滤处理得到高质量测序序列(cleanreads)，采用Trinity软件对高质量测序序列进行拼接得到转录本序列，取每条基因中最长的转录本作为unigene；(4)功能注释：使用BLAST软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG数据库比对，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGGOrthology结果，预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息；(5)差异基因的筛选：使用EBSeq进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达基因集；在差异表达分析过程中采用Benjamini-Hochberg方法对原有假设检验得到的显著性p值进行校正，并最终采用校正后的p值，即错误发现率(FDR，FalseDiscoveryRate)作为差异表达基因筛选的关键指标，将FDR小于0.05且差异倍数倍性变化(FC，FoldChange)大于等于2作为筛选标准；(6)差异基因的功能注释：基于基因在不同样品中的表达量，对识别到的差异表达基因进行功能注释，分别与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG数据库比对，获得上调或下调表达基因的注释信息；(7)性别决定相关基因的筛选：利用其余物种中已知与性别决定相关基因的序列在差异基因中进行筛选，最终得到达氏鲟雌雄性腺差异表达基因，所述基因序列具有SEQIDNO.1中的核苷酸序列；(8)实时定量PCR验证：对于所得具有SEQIDNO.1中的核苷酸序列的差异表达基因进行实时定量PCR的验证。进一步地，所述步骤(8)中的实时定量PCR反应体系为：上游引物F和下游引物R各0.5μL，待测达氏鲟样品模板1.0μL；RNaseFreeWater8.0μL。进一步地，所述上游引物F和下游引物R序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。进一步地，所述步骤(8)中的实时定量PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，70～95℃采集信号，40个循环。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：本专利技术利用高通量测序技术对达氏鲟进行性别差异基因的筛选，并进行了后期实时定量PCR验证，所获基因可以作为达氏鲟性别鉴定的候选基因，为今后达氏鲟性别鉴定，性别决定基因及性别决定机制的研究提供依据。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1达氏鲟样品收集及RNA提取从四川省水产研究所挑选两尾健康、性腺已分化的达氏鲟，解剖取其性腺进行totalRNA的提取，具体步骤如下：(1)将达氏鲟性腺组织约30mg放入预冷的研钵中，利用液迅速研磨成粉末，放入1.5mL离心管中，并加入1mLTRIzol；(2)离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静止3min；(3)4℃，12,000r/min离心10min，吸取上清放入新的离心管中；(4)加入与上清等体积的异丙醇，轻摇混匀，室温放置5-10min；(5)4℃，12,000r/min离心10min，弃去上清，小心吸去剩余异丙醇；(6)加入1mL75％的乙醇，充分洗涤沉淀，4℃，7，500r/min离心1min，短暂离心，吸去剩余乙醇，重复一次该步骤；(7)室温晾干乙醇，加入20μLDEPC处理水使RNA充分溶解；(8)取1uL左右的样品进行电泳检测RNA质量，并用紫外分光光度仪检测RNA浓度和质量。实施例2达氏鲟转录组的测序、拼接及组装样品检测合格后，进行文库构建，主要流程如下：(1)用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；(2)加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断；(3)以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseH和DNApolymeraseI合成第二条cDNA链，利用AMPureXPbeads纯化cDNA；(4)纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXPbeads进行片段大小选择；(5)最后通过PCR富集得到cDNA文库。文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent2100对文库的浓度和插入片段大小(InsertSize)进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，用IlluminaHiseq进行高通量测序，高通量测序得到的原始图像数据经IlluminaCasava碱基识别软件分析转化为原始测序(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF，其特征在于，所述基因序列具有SEQ ID No.1中的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种达氏鲟性腺差异表达基因GSDF，其特征在于，所述基因序列具有SEQIDNo.1中的核苷酸序列。2.权利要求1所述的达氏鲟性腺差异表达基因GSDF在达氏鲟性别鉴定、性别决定基因及性别决定机制中的应用。3.一种权利要求1所述的达氏鲟性腺差异表达基因GSDF的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)达氏鲟cDNA文库的构建：用TRIzol试剂盒提取达氏鲟组织RNA，构建达氏鲟转录组文库；(2)测序数据质量控制：高通量测序得到的原始图像数据经IlluminaCasava碱基识别软件分析转化为原始测序序列，随后对Rawdata进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量Reads获得高质量的Cleandata；(3)组装：原始测序序列经过滤处理得到高质量测序序列，采用Trinity软件对cleanreads进行拼接得到转录本序列，取每条基因中最长的转录本作为unigene；(4)功能注释：使用BLAST软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG数据库比对，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGGOrthology结果，预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息；(5)差异基因的筛选：使用EBSeq进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达基因集；在差异表达分析过程中采用Benj...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈叶雨，刘亚，龙治海，林珏，龚全，赖见生，杜军，宋明江，
申请(专利权)人：四川省农业科学院水产研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51