【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种川陕哲罗鲑内参基因及其荧光定量pcr引物与稳定性筛选方法。
技术介绍
1、川陕哲罗鲑(hucho bleekeri)作为我国特有物种，曾在岷江和青衣江上游、大渡河中上游、汉江支流渭水河和太白河以及秦岭南部山溪中分布，属长江上游珍稀鱼类。但由于过度捕捞、生态环境破坏等原因，使其自然资源量直线下降。目前，川陕哲罗鲑的研究主要集中在早期发育、形态特征、遗传多样性、资源保护等方面，分子方面研究还存在空缺。
2、实时荧光定量pcr主要是通过检测聚合酶链式反应中的荧光信号对特定dna模板进行定量检测的一种手段。其中，相对定量，即更具一个已知且表达稳定的内参基因作为参照，对待测基因的表达量进行检测。因此，这个内参基因的稳定性就显得尤为重要。β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因在动植物中被广泛用于相对表达量检测，但是根据不同的物种、不同发育阶段、不同营养状况等条件，内参基因的稳定性也是存在差异的。主要的内参候选基因还包括β2-微球蛋白(β2m)、延伸因子1α(elongation factor 1α，ef1α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，hprt1)和β微管蛋白基因(β-tubulin)等，挑选表达稳定的内参基因是进行实时定量pcr分析的重要前提，但目前有关川陕哲罗鲑内
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供川陕哲罗鲑内参基因及其荧光定量pcr引物与稳定性筛选方法，以解决现有缺少川陕哲罗鲑内参基因及其稳定性筛选方法的问题。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、一种川陕哲罗鲑内参基因，内参基因为：β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、延伸因子1α、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1和β微管蛋白基因；
4、β-肌动蛋白基因序列如seq id no.1所示，β2-微球蛋白基因序列如seq id no.2所示，延伸因子1α基因序列如seq id no.3所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因序列如seq idno.4所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因序列如seq id no.5所示，β微管蛋白基因序列如seq id no.6所示。
5、用于扩增上述的川陕哲罗鲑内参基因的引物，引物序列为：β-肌动蛋白基因扩增引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示，β2-微球蛋白基因扩增引物序列如seq idno.9和seq id no.10所示，延伸因子1α基因扩增引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因扩增引物序列如seq id no.13和seq id no.14所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因扩增引物序列如seq id no.15和seq id no.16所示，β微管蛋白基因扩增引物序列如seq id no.17和seq id no.18所示。
6、用于检测上述川陕哲罗鲑内参基因表达的荧光定量pcr引物，引物序列为：β-肌动蛋白基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.19和seq id no.20所示，β2-微球蛋白基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.21和seq id no.22所示，延伸因子1α基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.23和seq id no.24所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.25和seq id no.26所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.27和seq id no.28所示，β微管蛋白基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.29和seq id no.30所示。
7、一种用于川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选的试剂盒，包括上的荧光定量pcr引物。
8、一种川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选方法，包括以下步骤：
9、提取川陕哲罗鲑组织的rna，并反转录合成cdna，然后以cdna为模板，使用上述荧光定量pcr引物或试剂盒进行实时荧光定量分析，最后对结果进行组织稳定性分析。
10、进一步地，rna的提取方法包括以下步骤：取川陕哲罗鲑组织研磨，溶于rnaisoplus中，离心取上清液加入氯仿，混匀静置；再次离心后取上清液加入异丙醇，再次混匀静置；第三次离心去除上清液，洗涤，溶于depc水。
11、进一步地，川陕哲罗鲑组织包括脑、头肾、中肾、肌肉、心、后肠、十二指肠、皮肤、脾、肝、性腺、眼睛、鳃和胃中的一种。
12、进一步地，荧光定量分析的反应体系为20μl体系：tb green premix ex taq ii，模板cdna 1μl，荧光定量pcr引物正、反向引物各0.5μl，ddh2o8μl；
13、进一步地，荧光定量分析的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，62.6-63℃退火30s，共40个循环。
14、本专利技术具有以下有益效果：
15、本专利技术方法构建了六种内参基因的扩增引物和荧光定量pcr引物，通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，为研究川陕哲罗鲑基因表达水平的变化奠定良好的基础，有助于在对川陕哲罗鲑基因表达研究中获得可靠的标准化qrt-pcr数据，极大程度上节省实验技术人员时间，提高检测效率，同时检测结果稳定、可靠、准确，可广泛应用于川陕哲罗鲑科学研究。
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1.一种川陕哲罗鲑内参基因，其特征在于，所述内参基因为：β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、延伸因子1α、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1和β微管蛋白基因；
2.用于扩增权利要求1所述的川陕哲罗鲑内参基因的引物，所述引物序列为：β-肌动蛋白基因扩增引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，β2-微球蛋白基因扩增引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，延伸因子1α基因扩增引物序列如SEQ ID No.11和SEQID No.12所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因扩增引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因扩增引物序列如SEQ ID No.15和SEQ IDNo.16所示，β微管蛋白基因扩增引物序列如SEQ ID No.17和SEQ IDNo.18所示。
3.用于检测权利要求1所述川陕哲罗鲑内参基因表达的荧光定量PCR引物，所述荧光定量PCR引物序列为：β-肌动蛋白基因荧光定量PCR引物序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No
4.一种用于川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选的试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述的荧光定量PCR引物。
5.一种川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)中RNA的提取方法包括以下步骤：取川陕哲罗鲑组织研磨，溶于RNAiso Plus中，离心取上清液加入氯仿，混匀静置；再次离心后取上清液加入异丙醇，再次混匀静置；第三次离心去除上清液，洗涤，溶于DEPC水。
7.根据权利要求5所述的川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选方法，其特征在于，所述川陕哲罗鲑组织包括脑、头肾、中肾、肌肉、心、后肠、十二指肠、皮肤、脾、肝、性腺、眼睛、鳃和胃中的一种。
8.根据权利要求5所述的川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选方法，其特征在于，所述荧光定量分析的反应体系为20μL体系：TB Green Premix Ex Taq II 10μL，模板cDNA 1μL，荧光定量PCR引物正、反向引物各0.5μL，ddH2O8μL。
9.根据权利要求5所述的川陕哲罗鲑内参基因稳定性筛选方法，其特征在于，所述荧光定量分析的反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性10s，62.6-63℃退火30s，共40个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种川陕哲罗鲑内参基因，其特征在于，所述内参基因为：β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、延伸因子1α、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1和β微管蛋白基因；
2.用于扩增权利要求1所述的川陕哲罗鲑内参基因的引物，所述引物序列为：β-肌动蛋白基因扩增引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示，β2-微球蛋白基因扩增引物序列如seq id no.9和seq id no.10所示，延伸因子1α基因扩增引物序列如seq id no.11和seqid no.12所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因扩增引物序列如seq id no.13和seq id no.14所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶1基因扩增引物序列如seq id no.15和seq idno.16所示，β微管蛋白基因扩增引物序列如seq id no.17和seq idno.18所示。
3.用于检测权利要求1所述川陕哲罗鲑内参基因表达的荧光定量pcr引物，所述荧光定量pcr引物序列为：β-肌动蛋白基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.19和seq id no.20所示，β2-微球蛋白基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.21和seq id no.22所示，延伸因子1α基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.23和seq id no.24所示，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因荧光定量pcr引物序列如seq id no.25和seq id no.26所示，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓雲，李华，杨焕超，赖见生，陈叶雨，刘钊，陈彦伶，涂全宇，
申请(专利权)人：四川省农业科学院水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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