【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高效生产2'-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株的应用，属于合成生物学、微生物代谢工程技术、发酵工程技术和微生物基因工程等领域。
技术介绍
1、人乳寡糖(hmos)是一类在新生儿健康和发育中至关重要的结构多样的复杂寡糖。从结构组成来说，2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose，2'-fl)是在还原性末端连接有一个乳糖，在非还原端一个岩藻糖(fucose,fuc)通过α-1,2键与乳糖结构中的半乳糖(galactose,gal)连接。与其他物质相比，它在hmos中占比最高。研究表明，添加2'-fl的婴儿食品具有更接近母乳的营养成分和功效。许多研究显示，2'-fl能够调节婴儿肠道菌群的平衡，抵抗病原体附着和免疫调节，促进婴儿的大脑和神经发育。目前，2'-fl已进入商业生产阶段，但其产量、成本、质量和安全等因素限制了其产业化进程。
2、早期的科学研究直接从人乳中分离出2'-fl。目前，有三种主要的合成2'-fl的方法：化学合成、酶合成和全细胞生物合成。化学和酶合成2'-fl的生产过程复杂且效率低，这阻碍了其大规模生产。相比之下，全细胞生物合成方法可以利用工程细菌实现大规模生产，是上述方法的理想替代方法。2'-fl的胞内合成涉及两条途径。第一条被称为补救途径，在这一途径中，外源性l-岩藻糖通过l-岩藻糖激酶/gdp-岩藻糖焦磷酸化酶(l-fucokinase/gdp-fucose pyrophosphorylase,fkp)酶的催化转化为gdp-l-岩藻糖。然后，由α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化
3、目前，报道的生产方法通常使用甘油作为发酵碳源以获得高密度发酵和合成以获得高2'-fl产量。然而，甘油不便于在发酵过程中实时测定其含量，并且残留的甘油也难以与产物完全分离。使用葡萄糖作为碳源的生产过程更方便，成本也低于甘油。
4、综上所述，现有技术受限于当葡萄糖被用作2'-fl合成中的碳源时，会积累大量的中间代谢产物乙酸，最终导致2'-fl的产量较低。导致岩藻糖基化人乳寡糖的产量过低，达不到工业化生产的需求。
技术实现思路
1、[技术问题]
2、本专利技术要解决的技术问题是提供一株从两种碳源葡萄糖和甘油都可以高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株。
3、[技术方案]
4、为了解决上述技术问题，本专利技术将对2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径关键酶进行不同表达水平的调控，以提高途径效率，提高2’-岩藻糖基乳糖生产水平。
5、本专利技术提供了一种生产2’-岩藻糖基乳糖的重组菌株，以大肠杆菌为宿主，调控2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径酶的表达，包括，游离表达基因：过表达manb-manc基因簇，gmd-wcag基因簇，鸟苷激酶gsk，n端带有融合蛋白标签的2’-岩藻糖基乳糖合成酶futc，dna结合转录激活因子rcsa和rcsb，β-半乳糖苷透性酶lacy，糖外排转运蛋白seta，nadp(+)-依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf；敲除基因组基因：gdp-甘露糖甘露糖水解酶nudd(ncbi登录号为gene id:946559)，β-半乳糖苷酶lacz(ncbi登录号为gene id:945006)，gdp-甘露糖水解酶nudk(ncbi登录号为gene id:947072)，十一磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶wcaj(ncbi登录号为gene id:946583)，hslvu蛋白酶的atpase成分clpy(ncbi登录号为gene id:948430)，hslvu蛋白酶的肽酶成分clpq(ncbi登录号为gene id:948429)，lon蛋白酶lon(ncbi登录号为gene id:945085)，半乳糖苷o-乙酰转移酶laca(ncbi登录号为gene id:945674)，异柠檬酸裂解酶调节剂iclr(ncbi登录号为gene id:948524)，磷酸乙酰转移酶pta(ncbi登录号为gene id:946778)，转录双重调节因子arca(ncbi登录号为gene id:948874)，丙酮酸氧化酶poxb(ncbi登录号为gene id:946132)，丙酮酸甲酸裂解酶pflb(ncbi登录号为gene id:945514)，乳酸脱氢酶ldha(ncbi登录号为gene id:946315)，葡萄糖磷酸转运蛋白ptsg(ncbi登录号为gene id:945651)。
6、在本专利技术的一种实施方式中，所述融合蛋白标签为类泛素蛋白修饰分子sumo。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株利用质粒prsf-duet-1、pet-duet-1和/或pcdf-duet-1游离表达基因。
8、在本专利技术的一种实施方式中，通过双t7启动子起始基因的表达。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株利用prsf-duet-1质粒表达manb-manc基因簇和gmd-wcag基因簇。
10、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株利用pet-duet-1质粒表达基因gsk和futc。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株利用pcdf-duet-1质粒表达基因lacy、seta、rcsa、rcsb和zwf。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株利用rbs调控manb-manc基因簇和gmd-wcag基因簇的表达强度。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌株利用rbs29调控manb-manc基因簇，利用rbs34调节gmd-wcag基因簇。
14、在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌bl21 star(de3)、大肠杆菌k12 mg1655或大肠杆菌jm109。
15、在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌bl21 star(de3)。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manc和磷酸甘露糖变位酶manb的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述gdp-甘露糖-4,6-脱水酶gmd和gdp-岩藻糖合成酶wcag的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述dna结合转录激活因子rcsa和rcsb的编码基因的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示；
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述2'-岩藻糖基乳糖合成酶futc的编码基因的核苷酸序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，调控2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径酶的表达，包括，敲除基因组基因：敲除GDP-甘露糖水解酶NudD，β-半乳糖苷酶LacZ，GDP-甘露糖水解酶NudK，十一磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶WcaJ，HslVU蛋白酶的ATPase成分ClpY，HslVU蛋白酶的肽酶成分ClpQ，Lon蛋白酶Lon，半乳糖苷O-乙酰转移酶lacA的E.coli BL21(DE3)菌株基础上，再敲除异柠檬酸裂解酶调节剂iclR，磷酸乙酰转移酶ptA，转录双重调节因子arcA，丙酮酸氧化酶poxB，丙酮酸甲酸裂解酶pflB，乳酸脱氢酶ldhA，葡萄糖磷酸转运蛋白ptsG；游离表达基因：过表达ManB-ManC基因簇，Gmd-WcaG基因簇，DNA结合转录激活因子RcsA和RcsB，N端带有融合蛋白标签的2'-岩藻糖基乳糖合成酶FutC，β-半乳糖苷透性酶LacY，糖外排转运蛋白SetA，鸟苷激酶Gsk和NADP(+)-依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf；所述融合蛋白标签为类泛素蛋白修饰分子SUMO。
2.如权利要求1所述的一
3.如权利要求2所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用质粒pRSF-Duet-1、pET-Duet-1和/或pCDF-Duet-1游离表达基因。
4.如权利要求2或3所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用pRSF-Duet-1质粒表达ManB-ManC基因簇和Gmd-WcaG基因簇；利用pET-Duet-1质粒表达基因Gsk和FutC；利用pCDF-Duet-1质粒表达基因LacY、SetA、RcsA、RcsB和Zwf。
5.如权利要求1～4任一所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用RBS29调控ManB-ManC基因簇，利用RBS34调节Gmd-WcaG基因簇。
6.如权利要求1～5任一所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌BL21 star(DE3)、大肠杆菌K12 MG1655或大肠杆菌JM109。
7.如权利要求1所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述ManB-ManC基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Gmd-WcaG基因簇的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；所述DNA结合转录激活因子RcsA和RcsB的编码基因的核苷酸序列分别如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述2'-岩藻糖基乳糖合成酶FutC的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述β-半乳糖苷透性酶LacY的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述糖外排转运蛋白SetA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述鸟苷激酶Gsk的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述NADP(+)-依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Zwf的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述的蛋白标签为类泛素蛋白修饰分子SUMO，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
8.一种生产2’-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，以权利要求1～7任一所述重组菌株为发酵菌株生产制备2’-岩藻糖基乳糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法以甘油或者葡萄糖为单一碳源，以乳糖为底物。
10.权利要求1～7任一所述重组菌株，或权利要求8或9所述方法在生产2'-岩藻糖基乳糖或含有2'-岩藻糖基乳糖的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，调控2’-岩藻糖基乳糖从头合成途径酶的表达，包括，敲除基因组基因：敲除gdp-甘露糖水解酶nudd，β-半乳糖苷酶lacz，gdp-甘露糖水解酶nudk，十一磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶wcaj，hslvu蛋白酶的atpase成分clpy，hslvu蛋白酶的肽酶成分clpq，lon蛋白酶lon，半乳糖苷o-乙酰转移酶laca的e.coli bl21(de3)菌株基础上，再敲除异柠檬酸裂解酶调节剂iclr，磷酸乙酰转移酶pta，转录双重调节因子arca，丙酮酸氧化酶poxb，丙酮酸甲酸裂解酶pflb，乳酸脱氢酶ldha，葡萄糖磷酸转运蛋白ptsg；游离表达基因：过表达manb-manc基因簇，gmd-wcag基因簇，dna结合转录激活因子rcsa和rcsb，n端带有融合蛋白标签的2'-岩藻糖基乳糖合成酶futc，β-半乳糖苷透性酶lacy，糖外排转运蛋白seta，鸟苷激酶gsk和nadp(+)-依赖性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf；所述融合蛋白标签为类泛素蛋白修饰分子sumo。
2.如权利要求1所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用多拷贝表达质粒游离表达基因。
3.如权利要求2所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用质粒prsf-duet-1、pet-duet-1和/或pcdf-duet-1游离表达基因。
4.如权利要求2或3所述的一种生产2'-岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株利用prsf-duet-1质粒表达manb-manc基因簇和gmd-wcag基因簇；利用pet-duet-1质粒表达基因gsk和futc；利用pcdf-duet-1质粒表达基因lacy、seta、rcsa、rcsb和zwf。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张康，吴敬，王璐瑶，高圣琦，刘同乐，蔡博涵，张梦薇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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