采用人工基因线路筛选及量化各种酶活性的方法技术

本发明专利技术涉及检测并量化目标酶活性的方法以及基于该方法从宏基因组文库中筛选目标酶活性的方法。更具体地，本发明专利技术涉及采用构建的用于感应酚类化合物的人工基因线路GESS(基因的酶筛选系统)来检测并量化各种酶活性的方法，以及采用人工基因线路从宏基因组中筛选痕量目标酶活性的方法，由此获得目标酶基因。此外，当采用本发明专利技术的方法来筛选并量化目标酶活性时，可以以高通量(百万/天)在单细胞水平上从包括环境或宏基因组文库的各种基因群落中筛选出有用的基因。进一步地，可以控制基因线路对苯酚衍生物的敏感性以及其表达，从而基因线路可以快速地感应并量化各种酶活性。因此，本发明专利技术有利于在用于酶修饰的蛋白质工程技术中使用。特别地，本发明专利技术可以定量地研究酶活性，因此可以应用在分子进化技术中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及筛选及量化各种酶活性的方法，以及以高通量方式基于该方法从宏基因组文库中筛选酶活性的方法。更具体地，本专利技术涉及采用感测酚类化合物的人工基因线路来筛选及量化各种酶活性的方法，以及以高通量方式从宏基因组中筛选目标酶活性由此获得目标酶基因的方法。
技术介绍
生物催化剂被认为是包括用于生产能源、工业材料等的清洁技术的“经济可持续发展”的关键材料，人们已通过多种努力来筛选具有新的化学反应性、特异性和稳定性的酶。在固体培养基上高通量筛选抗生素抗性基因、生长必需的酶、几种工业酶(例如，淀粉酶、脂酶、蛋白酶等)及类似物的方法是已知的，但大多数酶功能依赖于个体的活性分析技术，这需要很长时间和很高成本。近年来，应用定向进化技术来从微生物基因组或宏基因组中获得新的遗传资源，或提高已知基因的活性来研制很有用的生物催化剂的研究，已经成为生物工程技术中的重要策略。因此，有必要发展用于高通量检测极小量酶的活性的新型高灵敏性筛选技术。从各种遗传资源，如微生物基因组和环境DNA(宏基因组)中获得新的酶基因的方法，包括基于序列的筛选方法，该筛选方法包含测序DNA，实施PCR反应，以及获得所扩增的基因。随着基因组信息的快速增长，该方法的可利用性逐日增加，且其优点在于可以只特异性地选择想要的基因。然而，该方法缺陷在于，由于其只能在目标基因的核苷酸序列的准确信息已知时才能应用，因此该应用限于一部分遗传资源。此外，人们也广泛采用了根据基因功能，即酶活性来选择基因的基于功能的筛选方法。为了通过此法筛选酶活性，主要采用了直接从环境样品，包括来自土壤、河流、工业废水、海水和森林的样品中分离微生物的方法。然而，能在实验室中实际培养的微生物种类的数量少到不及自然界中存在的微生物的1％。近年来，积极尝试了通过直接从环境样品中分离DNA而不培养微生物，来构建遗传资源如宏基因组文库的策略。因此，对开发直接从宏基因组文库检测工业上有用的酶活性的筛选技术的关注在增长。同时，高通量分析酶活性的主要技术包括：1)利用孔板的自动多重检测技术；2)观察固体培养基上的颜色变化或透明带(光环)的方法；以及3)利用营养缺陷型微生物的选择分离方法。这些方法是基于酶的实际活性，并因此优势在于能够准确地选择有想要功能的基因。然而，由于每种酶活性都需要各自的检测技术，因此这些方法的总体应用有限。另外，当外源基因在宿主细胞中的转录、翻译或表达水平低或诸如蛋白折叠或分泌的问题增多时，这些方法的效果也进一步减弱。实际上，对于源自具有高度遗传多样性并且其遗传特性未知的遗传资源(例如新的微生物基因组和宏基因组)的新型酶，它们在重组微生物中的表达水平很低，因而难以将上述高通量检测方法应用于这些酶。因此，一直需要发展新的高通量筛选原理，根据该原理，即使是表达水平很低的酶也可以以高灵敏性检测到其活性。本文中，关于在酵母三杂交体系中通过基于转录活化原理的基因工程技术检测酶(如细胞内蛋白酶)的活性的人工基因线路的研究被报道并受到关注。另外，采用作为细胞营养物的外源酶的作用得到的产物来检测酶活性，或将来自其它微生物的转录调控蛋白引入到重组大肠杆菌(E.coli)中，通过再设计微生物的代谢途径，来检测重组大肠杆菌中外源基因的酶活性的技术的研究活跃。此外，人们正积极致力于发展用于改变调控蛋白的底物特异性的蛋白质工程技术。例如，人们也研究了改变调控蛋白HbpR的底物特异性，使得HbpR由结合2-羟基联苯(2-HBP)，转向特异性识别以氯-代替羟基-的2-氯化联苯(2-CBP)(Beggah et al.，(2008)Microb.Biotechnol.1(1)：68-78)。因此，可以将采用调控蛋白来检测酶促反应产物用作筛选新型酶的创新技术。然而，这样的技术仅仅是筛选小量的底物和调控蛋白已被阐明的特异酶活性的技术，这些技术不能作为应用于不同的酶活性的通用系统。筛选新型酶的其它技术包括由Watanabe研究小组在2005年报道的SIGEX(底物-诱导基因表达筛选)。该技术以筛选其转录活性由添加的底物来诱导的启动子为基础。因此，这不是定向筛选酶活性的技术，而是非定向检测基因的技术。也就是说，该技术不检测与转录活化无关联的酶功能。由于这一技术可以使用FACS分析，因此具有短时间内处理大量样品的优点。然而，该技术难以应用于含有20-30kb大小的大基因的宏基因组文库中，且在文库中不会出现基因方向的GFP活化(Uchiyama et al.，(2005)Nat.Biotech.23：88-93)。同时，对检测酚类化合物的技术的研究是已知的(韩国专利登记号No.10-0464068)，但此前尚未报道运用该技术来检测酶活性的研究。本专利技术人已对能够检测各种酶活性的方法进行了研究。结果显示，基于能够释放酚类的各种酚-释放化合物可以在许多酶促反应中作为底物的事实，本专利技术人构建了检测酚类的人工基因线路，并发现该人工基因线路的应用能够测量表达受到诱导的报告基因，如荧光报告基因和抗生素抗性基因的定量活性。从而，通过采用这样的基因线路，从宏基因组文库中经高通量筛选(百万/天)收集并分离具有酪氨酸酚解酶和碱性磷酸酶活性的基因，本专利技术人确认了此技术有效性和一般用途，由此完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种采用人工基因线路筛选目标酶活性的方法，该方法包括以下步骤：(a)或者提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，或者提供在其染色体DNA或细胞质中含有该基因线路的微生物，该人工基因线路包含(i)编码识别酚类化合物的酚类化合物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基因和抗生素抗性基因构成的组，以及(iii)由调控酚类化合物-降解酶调控蛋白表达的启动子、与酚类化合物-降解酶调控蛋白结合来诱导下游报告基因表达的区域，以及调控报告基因表达的启动子组成的基因表达调控区域；(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；(c)将该克隆或基因文库以及用于检测酚类化合物的人工基因线路引入宿主微生物中来制备重组微生物；(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理该重组微生物；以及(e)检测报告蛋白的活性，该报告蛋白的表达是通过感应由酶促反应释放的酚类化合物来诱导的。本专利技术的另一目的是提供一种采用人工基因线路量化目标酶活性的方法，该方法包括以下步骤：(a)或者提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，该人工基因线路包含(i)编码识别酚类化合物的酚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.08 KR 10-2009-0050596;2009.12.23 KR 10-2001.一种采用人工基因线路筛选目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，所述人工基因线路包含
(i)编码识别酚类化合物的酚类化合物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一
个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基因和抗生素抗性基因构成的组，以及
(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类化合物-降解酶调控蛋白表达的启动
子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合来诱导下游报告基因表达的区域，
以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库以及用于检测所述酚类化合物的所述人工基因
线路引入到宿主微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)检测报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
2.一种采用人工基因线路筛选目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供在其染色体DNA或细胞质中含有用于检测酚类化合物的人工基
因线路的微生物，所述人工基因线路包含(i)编码识别酚类化合物的酚类化合
物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基
因和抗生素抗性基因构成的组，以及(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类
化合物-降解酶调控蛋白表达的启动子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合
来诱导下游报告基因表达的区域，以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库引入到含有用于检测所述酚类化合物的所述人
工基因线路的微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)检测报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
3.一种采用人工基因线路来量化目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，所述人工基因线路包含
(i)编码识别酚类化合物的酚类化合物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一
个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基因和抗生素抗性基因构成的组，以及
(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类化合物-降解酶调控蛋白表达的启动
子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合来诱导下游报告基因表达的区域，
以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库以及用于检测所述酚类化合物的所述人工基因
线路引入到宿主微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)量化报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
4.一种采用人工基因线路来量化目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供在其染色体DNA或细胞质中含有用于检测酚类化合物的人工基
因线路的微生物，所述人工基因线路包含(i)编码识别酚类化合物的酚类化合
物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基
因和抗生素抗性基因构成的组，以及(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类
化合物-降解酶调控蛋白表达的启动子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合
来诱导下游报告基因表达的区域，以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库引入到含有用于检测所述酚类化合物的所述人
工基因线路的微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)量化报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
5.一种从宏基因组文库中筛选能够通过酶反应而释放酚类化合物的目标酶
的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供来自天然环境的宏基因组文库；
(b)提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，所述人工基因线路包含
(i)编码识别酚类化合物的酚类化合物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一
个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基因和抗生素抗性基因构成的组，以及
(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类化合物-降解酶调控蛋白表达的启动
子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合来诱导下游报告基因表达的区域，
以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(c)将所述宏基因组文库和所述人工基因线路引入到宿主微生物中来构建
转化微生物文库；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述转化
微生物文库；
(e)测量通过感应由所述酶促反应释放的所述酚类化合物来诱导表达的报
告蛋白的活性，由此实施具有经所述酶促反应释放所述酚类化合物的活性的微生
物的高通量筛选；以及
(f)从经筛选的微生物中收集能够经酶促反应释放所述酚类化合物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李升九，罗有真，崔守林，宋在俊，崔钟铉，金熙植，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：