采用人工基因线路筛选及量化各种酶活性的方法技术

本发明专利技术涉及检测并量化目标酶活性的方法以及基于该方法从宏基因组文库中筛选目标酶活性的方法。更具体地，本发明专利技术涉及采用构建的用于感应酚类化合物的人工基因线路GESS(基因的酶筛选系统)来检测并量化各种酶活性的方法，以及采用人工基因线路从宏基因组中筛选痕量目标酶活性的方法，由此获得目标酶基因。此外，当采用本发明专利技术的方法来筛选并量化目标酶活性时，可以以高通量(百万/天)在单细胞水平上从包括环境或宏基因组文库的各种基因群落中筛选出有用的基因。进一步地，可以控制基因线路对苯酚衍生物的敏感性以及其表达，从而基因线路可以快速地感应并量化各种酶活性。因此，本发明专利技术有利于在用于酶修饰的蛋白质工程技术中使用。特别地，本发明专利技术可以定量地研究酶活性，因此可以应用在分子进化技术中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及筛选及量化各种酶活性的方法，以及以高通量方式基于该方法从宏基因组文库中筛选酶活性的方法。更具体地，本专利技术涉及采用感测酚类化合物的人工基因线路来筛选及量化各种酶活性的方法，以及以高通量方式从宏基因组中筛选目标酶活性由此获得目标酶基因的方法。
技术介绍
生物催化剂被认为是包括用于生产能源、工业材料等的清洁技术的“经济可持续发展”的关键材料，人们已通过多种努力来筛选具有新的化学反应性、特异性和稳定性的酶。在固体培养基上高通量筛选抗生素抗性基因、生长必需的酶、几种工业酶(例如，淀粉酶、脂酶、蛋白酶等)及类似物的方法是已知的，但大多数酶功能依赖于个体的活性分析技术，这需要很长时间和很高成本。近年来，应用定向进化技术来从微生物基因组或宏基因组中获得新的遗传资源，或提高已知基因的活性来研制很有用的生物催化剂的研究，已经成为生物工程技术中的重要策略。因此，有必要发展用于高通量检测极小量酶的活性的新型高灵敏性筛选技术。从各种遗传资源，如微生物基因组和环境DNA(宏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.08 KR 10-2009-0050596;2009.12.23 KR 10-2001.一种采用人工基因线路筛选目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，所述人工基因线路包含
(i)编码识别酚类化合物的酚类化合物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一
个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基因和抗生素抗性基因构成的组，以及
(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类化合物-降解酶调控蛋白表达的启动
子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合来诱导下游报告基因表达的区域，
以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库以及用于检测所述酚类化合物的所述人工基因
线路引入到宿主微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)检测报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
2.一种采用人工基因线路筛选目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供在其染色体DNA或细胞质中含有用于检测酚类化合物的人工基
因线路的微生物，所述人工基因线路包含(i)编码识别酚类化合物的酚类化合
物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基
因和抗生素抗性基因构成的组，以及(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类
化合物-降解酶调控蛋白表达的启动子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合
来诱导下游报告基因表达的区域，以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库引入到含有用于检测所述酚类化合物的所述人
工基因线路的微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)检测报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
3.一种采用人工基因线路来量化目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，所述人工基因线路包含
(i)编码识别酚类化合物的酚类化合物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一
个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基因和抗生素抗性基因构成的组，以及
(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类化合物-降解酶调控蛋白表达的启动
子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合来诱导下游报告基因表达的区域，
以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库以及用于检测所述酚类化合物的所述人工基因
线路引入到宿主微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)量化报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
4.一种采用人工基因线路来量化目标酶活性的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供在其染色体DNA或细胞质中含有用于检测酚类化合物的人工基
因线路的微生物，所述人工基因线路包含(i)编码识别酚类化合物的酚类化合
物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基
因和抗生素抗性基因构成的组，以及(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类
化合物-降解酶调控蛋白表达的启动子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合
来诱导下游报告基因表达的区域，以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(b)提供含有待筛选酶的编码基因的克隆或基因文库；
(c)将所述克隆或基因文库引入到含有用于检测所述酚类化合物的所述人
工基因线路的微生物中来制备重组微生物；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述重组
微生物；以及
(e)量化报告蛋白的活性，所述报告蛋白的表达是通过感应由所述酶促反
应释放的所述酚类化合物来诱导的。
5.一种从宏基因组文库中筛选能够通过酶反应而释放酚类化合物的目标酶
的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供来自天然环境的宏基因组文库；
(b)提供用于检测酚类化合物的人工基因线路，所述人工基因线路包含
(i)编码识别酚类化合物的酚类化合物-降解酶调控蛋白的基因，(ii)至少一
个报告基因，选自由荧光蛋白-编码基因和抗生素抗性基因构成的组，以及
(iii)基因表达调控区域，由调控所述酚类化合物-降解酶调控蛋白表达的启动
子、与所述酚类化合物-降解酶调控蛋白结合来诱导下游报告基因表达的区域，
以及调控所述报告基因表达的启动子组成；
(c)将所述宏基因组文库和所述人工基因线路引入到宿主微生物中来构建
转化微生物文库；
(d)采用能够经酶促反应释放酚类化合物的酚-释放化合物来处理所述转化
微生物文库；
(e)测量通过感应由所述酶促反应释放的所述酚类化合物来诱导表达的报
告蛋白的活性，由此实施具有经所述酶促反应释放所述酚类化合物的活性的微生
物的高通量筛选；以及
(f)从经筛选的微生物中收集能够经酶促反应释放所述酚类化合物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李升九，罗有真，崔守林，宋在俊，崔钟铉，金熙植，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：