本申请涉及纯化含Fc区蛋白的方法。具体地，本申请提供了通过将具有Fc区的多肽，例如，抗体或抗体融合吸附到Fc结合剂，例如，A蛋白或G蛋白上，然后用二价阳离子盐缓冲液洗涤，以除去杂质，随后回收被吸附的多肽来纯化所述具有Fc区的多肽的方法。本申请的特征还在于洗脱被纯化多肽的方法及纯化系列中该方法的并入。本申请还提供了包括执行该方法的组分和使用说明书的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】纯化含Fe区蛋白的方法 本申请是国际申请日2006年6月16日、国际申请号PCT/US2006/023478于2007 年12月17日进入中国国家阶段、申请号200680021590. X、专利技术名称"纯化含Fe区蛋白的 方法"的申请的分案申请。 相关申请 本申请要求2005年6月17日提交的申请号为60/691821的临时专利申请"纯化 含 Fe 区蛋白的方法（METHODS OF TORIFYING FcREGION CONTAINING PROTEINS)"的优先权。 该申请的全部内容并入本文。 专利技术背景 抗体是许多动物，特别是人类的免疫系统的功能强大的组分。重组技术的最新进 展使得事实上针对任何靶，例如，癌细胞，细菌和病毒的抗体的产生成为可能。通常地，抗体 用已被工程化成表达高水平的所述抗体的细胞系产生。随后，工程化细胞系在包括糖，氨基 酸和生长因子及各种蛋白，包括例如，血清蛋白的复杂混合物的培养物中生长。然而，从细 胞副产物和培养物组分中分离完全抗体至足以用于研宄或用作治疗剂的纯度形成了严峻 挑战。如果准备将抗体用作药物向人类给药，则抗体分子的纯化尤为关键。 传统抗体纯化方案（或系列）通常包括色谱步骤，所述色谱步骤利用了与多种杂 质的结合或截留相比，抗体分子优先结合或被色谱柱的固相（或官能化固相）截留的能力。 已建议或执行的纯化抗体的方案为：首先将含有CH2/CH3区的蛋白结合在固相上所固定的 A蛋白上，然后通过用疏水电解质溶剂洗涤固相，除去固相上所结合的杂质，接着从所述固 相上回收含有CH2/CH3区的蛋白。然而，这些方案的限制在于用来优先结合含有CH2/CH3 区的蛋白的条件同样支持杂质（例如，具有不完全CH2/CH3区的抗体）的结合。在人用治 疗剂的开发过程中，这些杂质是非常不希望有的。 因此，存在着改进对具有恒定区的蛋白或多肽，尤其是在细胞培养物中产生的具 有Fe区的蛋白（例如，抗体）的纯化的需求。 专利技术概述 在多个方面，本专利技术的特征在于将具有Fe区的蛋白从包括该蛋白和一种或多种 杂质的源液中分离的方法。在本专利技术的方法中，将具有Fe区的蛋白（靶蛋白）吸附到Fe结 合剂上，然后用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤Fe结合剂，以除去一种或多种杂质。接 着在洗脱溶液中从Fe结合剂上回收该蛋白。本专利技术的方法对除去例如内含子连读变异体 类（IRT)，二硫键缺失类（UDB)和/或低分子量变异体类（LMW)这样的杂质尤其有效。本发 明的方法在除去例如宿主细胞蛋白（HCP)和DNA这样的杂质方面同样有效。 本专利技术的方法包括一个或多个色谱分离步骤，另外，还可以包括一个或多个过滤 步骤。所述色谱分离步骤可以是连续或不连续的（例如，分批方法），或者为两者的组合。 在多种实施方案中，本方法包括一个或多个过滤步骤，例如，以除去病毒，浓缩和缓冲含有 靶蛋白的溶液，以及除去微生物污染物。 在多种实施方案中，含Fe区蛋白是抗原结合多肽（例如，抗体或其片段）或免疫 粘附素（例如，TNF受体免疫粘附素）。在多种实施方案中，含Fe区蛋白是抗体融合蛋白， 鼠抗体，嵌合抗体或人源化抗体。在优选实施方案中，含Fe区蛋白是人或人源化抗IL-13 抗体。或者，在其它实施方案中，含Fe区蛋白可以结合例如A β，⑶3,⑶52, VEGF，EGFR，⑶3 3，CD20，HER-2，TNFa，CD25，RSV，IgE，gp IIb/IIIa，CDlla或 α4整联蛋白的抗原。 在多种实施方案中，含Fe区蛋白是重组产生的。在多种实施方案中，含Fe区蛋白 是在中国仓鼠卵巢（CHO)细胞中重组产生的。 在多种实施方案中，所述一种或多种杂质包括一种或多种宿主细胞蛋白，宿主细 胞DNA，细胞培养物蛋白，具有Fe区的非所需种类的蛋白及其混合物。例如，在多种实施方 案中，具有Fe区的非所需种类的蛋白包括一种或多种具有内含子连读序列的抗体链或其 片段，一种或多种具有不正确二硫键的抗体链或其片段，半抗体或其片段，轻链二聚体或其 片段和重链二聚体或其片段。 在一个方面，本专利技术的方法通过首先将具有Fe区的蛋白吸附到Fe结合剂上，然后 用含有二价阳离子盐的缓冲溶液洗涤所述Fe结合剂，以除去一种或多种杂质，随后从所述 Fe结合剂上回收所述蛋白，从包括所述蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化具有Fe区的 蛋白。在多种实施方案中，将所述蛋白吸附到Fe结合剂上的步骤和用含有二价阳离子盐的 缓冲溶液洗涤所述Fe结合剂的步骤在约2°C至约24°C的温度范围内进行。在多种实施方 案中，从所述Fe结合剂回收所述蛋白的步骤包括用pH范围为约2. 0至约6. 5的洗脱缓冲 液洗脱所述蛋白。 在多种实施方案中，Fe区结合剂包括一种或多种A蛋白和G蛋白。在优选实施方 案中，所述Fe结合剂被固定在固相上。该固相可以包括，例如，一种或多种珠，琼脂糖基质， 二氧化硅及其混合物。 用来洗涤Fe结合剂的缓冲液中所存在的二价阳离子盐可以包括，例如，离液序列 高的盐。适用于制备所述洗涤缓冲溶液的二价阳离子盐包括但不限于氯化镁，氯化钙，氯化 镍及其混合物。在多种实施方案中，适用于制备所述洗涤缓冲溶液的二价阳离子盐包括但 不限于二价II族（例如，镁，妈，钡等）阳离子，二价过度金属（例如，铜，镍，锰等）阳离子 的硫氰酸盐（SCN0，高氯酸盐（CKV)，硝酸盐（NCV)，氯化盐和溴化盐及这些盐的组合物。 在多种实施方案中，含有二价阳离子盐的缓冲溶液的pH值范围为约4至约9,在某 些实施方案中，为约4至约8,约4. 5至约7. 5,或约6至约8。此处所述范围内所包括的值 和范围和/或中间值也希望在本专利技术的范围内。例如，所述二价阳离子盐的pH值为约7. 1 至约7. 9,约7. 2至约7. 9,约7. 3至约7. 7,约7. 4至约7. 6,约4至约5,约5至约6,约6 至约7或约8至约9。 此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本专利技术的范围内。例如，所述二 价阳离子盐的pH为至少约（或约）4. 5, 5, 5. 5, 6,6. 5, 7, 7. 5或8。 在多种实施方案中，缓冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度范围为约0.1 M至约 5M，在某些实施方案，为约0. 5M至约3M，约1.0 M至约3M或约0. 6M至约2. 5M。例如，所述二 价阳离子缓冲液可以包括至少约〇. 6M的0&(：12或至少约2M的MgCl 2或至少约2M的CaCl 2。 此处所述范围内所包括的值和范围和/或中间值也希望在本专利技术的范围内。例如，所述缓 冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度为约〇. 5M至约0. 75M，约0. 5M至约0. 8M，约0. 5M至 约 0. 9M，约 0. 5M 至 I. 0M，约 0. 5M 至 2M，约 I. 5M 至约 2. 0M，约 I. 5M 至约 2. 5M，约 I. 5M 至约 3. OM或约2. 5M至约3M。 此外，希望以此处所述值作为上限或下限的范围在本专利技术的范围内。例如，所述缓 冲溶液所含有的二价阳离子盐的浓度为至少约（或约）0. 6M，1M，I. 5M，2M，2. 5M或3M。在多 种实施方案中，含有二价阳离子盐的缓冲溶液的温度范围为约2°C至约24°C。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
从包括具有Fc区的蛋白和一种或多种杂质的源液中纯化所述具有Fc区的蛋白的方法，其包括步骤：将所述蛋白吸附在Fc结合剂上；用含有浓度0.5M至3M的CaCl2的缓冲溶液洗涤与所述蛋白结合的Fc结合剂以减少一种或多种杂质，其中所述一种或多种杂质选自：内含子连读变异体类，二硫键缺失变异体类，低分子量种类，宿主细胞蛋白，或宿主细胞DNA；以及使用pH范围为2.0至4.0的洗脱缓冲液从所述Fc结合剂洗脱所述蛋白，其中具有Fc区的蛋白是从源液纯化的。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：兰加纳坦·戈达瓦蒂，蒂莫西·伊斯克拉，
申请(专利权)人：惠氏有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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