用于CDR移植的接受体框架制造技术

本发明专利技术涉及一种抗体接受体框架，并且涉及用于在使用特别充分适合的抗体接受体框架下移植非人抗体，例如兔抗体的方法。通过本发明专利技术方法产生的抗体可用于多种诊断和治疗应用中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】用于CDR移植的接受体框架 专利技术背景 作为治疗剂和诊断剂，单克隆抗体、它们的缀合物和衍生物在商业上极其重要。通 常在单次低剂量注射之后，非人抗体在患者中引发强烈免疫反应（Schroff，1985Cancer Res45:879-85 ；Shawler.JImmunol1985 135:1530-5 ；Dillman,CancerBiother1994 9:17-28)。因此，开发了用于降低鼠类和其它啮齿动物抗体的免疫原性的若干方法以及用 以使用例如转基因小鼠或噬菌体展示来制备完全人抗体的技术。嵌合抗体是工程化抗体， 其组合啮齿动物可变区与人恒定区（例如BoulianneNature1984 312:643-6)，使免疫原 性问题显著减少（例如LoBuglio，ProcNatlAcadSci1989 86:4220-4 ;Clark,Immunol Today2000 21:397-402)。人源化抗体也是工程化抗体，其中啮齿动物可变区序列自身被 工程化来尽可能接近人序列，同时保留至少原始CDR，或其中将来自啮齿动物抗体的CDR移 植到人抗体的框架中（例如Riechmann,Nature1988 332:323-7 ;US5, 693, 761)。兔多克 隆抗体广泛用于生物测定，如ELISA或蛋白质印迹。多克隆兔抗体时常由于它们的亲和力 通常高得多而比多克隆啮齿动物抗体更有利。此外，兔时常能够引发针对在小鼠中免疫原 性不良和/或当用于噬菌体展示时不产生良好结合剂的抗原的良好抗体反应。由于兔抗体 具有这些熟知优势，它们将理想地用于发现和开发治疗性抗体。通常不进行此举的原因主 要是由于产生单克隆兔抗体的技术挑战。因为骨髓瘤样肿瘤在兔中是未知的，所以用以产 生单克隆抗体的常规杂交瘤技术不可用于兔抗体。提供兔抗体表达细胞的融合细胞系伴侣 的开拓性工作已由Knight和同事进行（Spieker-Polet等，PNAS1995, 92:9348-52)，并且 一种改进融合伴侣细胞系已由Pytela等在2005年描述（参见例如美国专利号7429487)。 然而，这个技术并未广泛推广，因为相应诀窍基本上由单一研宄组控制。涉及通过RT-PCR 自所选抗体表达细胞克隆抗体的用于产生单克隆抗体的替代性方法描述于文献中，但从未 对兔抗体进行成功报道。 类似小鼠抗体，预期兔抗体如果用于人疗法，那么会引发强烈免疫反应，因此，兔 抗体在它们可临床使用之前需要被人源化。然而，归因于兔与小鼠之间，并且相应地，兔抗 体与人抗体之间的结构差异，用于制备人源化啮齿动物抗体的方法并不能容易地外推用于 兔抗体。举例来说，轻链CDR3(CDRL3)常比先前已知的来自人或小鼠抗体的CDRL3长得多。 存在少许描述于先前技术中的兔抗体人源化方法，然而，其不是其中非人供体 的⑶R被移植在人接受体抗体上的经典移植方法。W0 04/016740描述一种所谓"表面重 塑"策略。"表面重塑"策略的目标在于重新塑造非人框架的溶剂可及残基以使它们变得 更类人。如W0 04/016740中所述的用于兔抗体的类似人源化技术在本领域中是已知的。 W008/144757与W005/016950两者均公开用于使兔单克隆抗体人源化的方法，其涉及比较 亲本兔抗体的氨基酸序列与类似人抗体的氨基酸序列。随后，改变亲本兔抗体的氨基酸序 列以使它的框架区在序列方面更类似于类似人抗体的等效框架区。为获得良好结合能力， 需要个别地针对各免疫结合剂进行费力开发尝试。 上述方法的一个潜在问题是不使用人框架而是使兔框架工程化以使它看起来更 类人。所述方法携有包埋在蛋白质的核心中的氨基酸链段仍然可能包含免疫原性T细胞表 位的风险。 迄今为止，申请人尚未鉴定通过应用现有技术状态移植方法加以人源化的兔抗 体。这可能用兔CDR可十分不同于人或啮齿动物CDR的事实来解释。如本领域中所知，许 多兔VH链相对于鼠类和人对应物具有额外成对半胱氨酸。除在cys22与cys92之间形成 的保守二硫桥之外，也存在cyS21-cyS79桥，以及在一些兔链中在⑶RH1的末个残基与⑶R H2的首个残基之间形成的⑶R间S-S桥。此外，多对半胱氨酸残基常见于⑶R-L3中。此 外，许多兔抗体CDR不属于任何先前已知的典型结构。具体来说，CDR-L3常比人或鼠类对 应物的⑶R-L3长得多。 因此，将非人⑶R抗体移植到人框架中是主要蛋白质工程任务。必须在使天然环 构象得以保留以达成抗原结合下进行将抗原结合环自天然进化的框架转移至不同人工选 择的人框架。常常在环移植之后，抗原结合亲和力被极大降低或消除。在移植抗原结合环 时使用谨慎选择的人框架会使人源化分子中保留结合亲和力的可能性最大（Roguzka等 1996)。尽管可在文献中获得的许多移植实验提供用于CDR移植的大致指导，但不可能概括 某一样式。典型问题在于在移植⑶R环之后损失特异性、稳定性或可产生性。 因此，对用于可靠并快速使兔抗体人源化以用作治疗剂和诊断剂的改进方法存在 紧急需要。此外，对用于可靠使兔抗体人源化，从而提供具有药物样生物物理学性质的功能 性抗体和/或抗体片段的人接受体框架存在需要。 专利技术概述 已惊人地发现通过质量控制（QC)测定（如W0 0148017中以及AufderMaur等 (2001)，FEBSLett508,第407-412页中所公开）鉴定的高度可溶性和稳定人抗体框架特 别适于接纳来自其它非人动物物种的CDR，例如兔CDR。因此，在第一方面，本专利技术提供特定 人抗体的重链可变区（所谓"a58"VH框架序列），其尤其适合作为来自具有不同结合特异 性的多种抗体，特别是来自兔抗体的CDR的接受体，而与二硫桥是否存在于CDR中无关。 通过将兔CDR移植到这个可高度相容的可变链框架中产生的人源化免疫结合剂 始终并可靠保留供体CDR所源于的兔抗体的空间取向。因此，供体免疫结合剂的结构相关 位置无需被引入接受体框架中。归因于这些优势，可达成在不优化或少许优化结合能力下 对兔抗体的高通量人源化。 因此，在另一方面，本专利技术提供用于将兔和其它非人CDR移植到本文公开的可溶 性和稳定轻链和/或重链人抗体框架序列中，由此产生具有优越生物物理学性质的人源化 抗体的方法。具体来说，通过本专利技术方法产生的免疫结合剂展现优越功能性质，如可溶性和 稳定性。 附图简述图1描绘在本文中用于将抗原结合位点自兔单克隆抗体移植到高度可溶性和稳 定人抗体框架中的CDRH1定义。 图2 :对自Kabat数据库提取的兔抗体序列的分析确认可变重链的⑶R3通常比它 的鼠类对应物长3个氨基酸。 专利技术详述 定义 为使本专利技术可更易于理解，将如下定义某些术语。其它定义在整篇详述中阐述。 术语"抗体"是指完整抗体和任何抗原结合片段。术语"抗原结合多肽"和"免疫 结合剂"在本文中同时使用。"抗体"是指任选糖基化的包含通过二硫键相互连接的至少两 个重（H)链和两个轻（L)链的蛋白质或其抗原结合部分。各重链包含重链可变区（在本文 中缩写为％)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。各轻链包含 轻链可变区（在本文中缩写为')和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人重链接受体框架，其包含SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：D·艾施尔，
申请(专利权)人：艾斯巴技术诺华有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH