青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用技术

本发明专利技术公开了一种青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用，所述方法为：获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；将PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体；将该超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，得到青霉基因工程菌。本发明专利技术获得的青霉工程菌产脂肪酶能力强，青霉工程菌制备的脂肪酶酶活比出发菌青霉野生菌提高了100％～150％。

【技术实现步骤摘要】
青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌的应用
本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种青霉基因工程菌的制备方法，以及所述青霉基因工程菌在制备脂肪酶中的应用。
技术介绍
近年来，脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)在工业应用方面取得了很大进展。碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻工业等领域得到广泛的应用，并已经成为全世界酶制剂市场上重要的品种。脂肪酶可以从动物、植物提取，也可以由多种微生物产生。由于微生物脂肪酶种类多，来源广，周期短，具有比动物、植物脂肪酶更广的pH、作用温度，更多的专一性类型底物，便于工业化生产和提纯，所以在酶的理论研究和实际应用中有更重要的作用。基于微生物脂肪酶的众多优点，人们一直期望获得产脂肪酶能力强的微生物菌株。在现有的技术中，通过对大量的微生物菌种进行选育，已经获得了一种产碱性脂肪酶能力较强的扩展青霉(P.expansium)菌株,并经过多年的诱变育种和发酵工艺改进,其产脂肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费力，而且收效不明显，目前通过采用这些方法来提高该菌株产脂肪酶的能力已经非常困难。因此，基于同源表达技术之上的遗传工程改良将是进一步提高扩展青霉产脂肪酶能力的高效手段。在真菌的遗传转化载体构建中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gpd)启动子通常被认为是表达目标基因的理想候选启动子。中国专利CN102154340A公开了一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法，该方法是利用构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA驱动扩展青霉内源性脂肪酶基因的高效表达，脂肪酶的酶活力最高达6210IU/mL，最低也达5210IU/mL。虽然使用异源甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子构建表达载体非常普遍，但是载体上的基因在某些真菌受体中也有不表达的情况发生。因此，人们希望使用内源启动子以期载体上的基因在受体中高效表达。经过对现有技术的文献检索发现，Moralejo, F.J.等在《Applied andEnvironmental Microbiology)) 1999 年第 3 期 1168-1174 页发表了题为((Thaumatinproduction in Aspergilus awamori by use of expression cassettes with strongfungal promoters and high gene dosage)) 一文，文中评述，产黄青霉 Penicilliumchrysogenum的pcbC启动子或产黄头孢霉Acremonium chrysogenum的B2启动子构建不同的表达盒在泡盛曲霉Aspergillus awamori中表达时,表达产量分别为7.7mg/L和1.6mg/L，相反，如果换用泡盛曲霉自身的启动子时，表达产量能达到llmg/L。这表明，同种特异性的启动子具有更好的启动表达效果。`由上所述，专利技术一种由同源启动子驱动青霉内源性脂肪酶基因的高效表达的基因工程菌是提高青霉产脂肪酶能力的高效手段。
技术实现思路
本专利技术提供一种青霉基因工程菌的制备方法及青霉基因工程菌在制备脂肪酶中的应用，所述方法是一种利用扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP驱动扩展青霉内源性脂肪酶基因高效表达的方法，所述方法获得的青霉工程菌产脂肪酶能力强，所述青霉工程菌制备的脂肪酶酶活力比青霉工程菌的出发菌青霉野生菌提高了 100%~150%。本专利技术采用的技术方案是提供一种青霉基因工程菌的制备方法，所述方法包括如下步骤:(I)获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；(2)分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；(3)将所述PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体； (4)将含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，得到所述的青霉基因工程菌。所述扩展青霉甘油醒-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。其中，所述青霉囷为扩展青霉。其中，所述潮霉素抗性表达盒为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子PtrpC驱动的hpt基因表达盒。其中，所述目标质粒为含有T边界的质粒，为pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300、pHB 中的一种。具体地，所述方法包括如下步骤:(I)利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；(2)进行扩展青霉基因组DNA的抽提；(3)PCR扩增PEL和TtrpC，产物经凝胶回收后克隆至目标质粒，得到重组质粒；⑷PCR扩增PgpdP后将PgpdP克隆至步骤(3)得到的重组质粒的相应位点，得到含PEL基因表达盒的载体；(5)利用限制性酶切技术获得PEL基因表达盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重组质粒上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；(6)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体通过冻融法转化工程农杆菌；(7)将青霉接种培养20天左右，收集成熟孢子；(8)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体的工程农杆菌接种于含有抗生素的LB液体培养基中过夜培养，用含有抗生素的MM培养基重新活化；吸取适量的培养物离心去上清，并用頂培养基稀释至0D_ = 0.15左右，然后再培养至OD6tltl = 0.5~0.6 ;(9)将第(7)步得到的新鲜孢子配制成悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，均匀涂到铺在含CM培养基上的玻璃纸上，进行共培养，之后将玻璃纸反铺到选择培养基上，进行选择培养，然后揭下玻璃纸，等待转化子长出，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半頂培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。更进一步地，所述方法包括如下步骤:(I)利用限制性内切酶将潮霉素抗性表达盒酶切下来，克隆到质粒PCAMBIA2300，获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2302 ；(2)利用高盐低pH方法进行扩展青霉DNA的抽提；(3)以步骤⑵中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增PEL ；以质粒pAN7_l为模板扩增TtrpC，然后将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收，克隆至pMD18_T载体上，得到载体 pMDlg-T:: PEL-TtrpC ；(4)以步骤⑵中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增强启动子PgpdP，片段经限制性内切酶消化后克隆至PMD18-T:: PEL-TtrpC，得到含有PEL基因表达盒的载体pMD18_T::PgpdP-PEL-TtrpC ；(5)利用限制性内切酶对载体pMD18-T:: PgpdP-PEL-TtrpC进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；(2)分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛?3?磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；(3)将所述PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体；(4)将含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEI基因表达盒转化到青霉菌株中，得到所述的青霉基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种青霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒； (2)分别克隆青霉脂肪酶基因PEL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子PgpdP和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子TtrpC，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒； (3)将所述PEL基因表达盒克隆到潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体； (4)将含潮霉素筛选标记PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEI基因表达盒转化到青霉菌株中，得到所述的青霉基因工程菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述青霉菌为扩展青霉。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述潮霉素抗性表达盒为构巢曲霉色氨酸合成酶启动子PtrpC驱动的hpt基因表达盒。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标质粒为含有T边界的质粒，为pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300、pHB 中的一种。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆到目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒； (2)进行扩展青霉基因组DNA的抽提； (3)PCR扩增PEL和TtrpC，产物经凝胶回收后克隆至目标质粒，得到重组质粒； (4)PCR扩增PgpdP后将PgpdP克隆至步骤(3)得到的重组质粒的相应位点，得到含PEL基因表达盒的载体； (5)利用限制性酶切技术获得PEL基因表达盒，然后克隆至含有潮霉素抗性的重组质粒上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体； (6)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体通过冻融法转化工程农杆菌； (7)将青霉接种培养20天左右，收集成熟孢子； (8)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体的工程农杆菌接种于含有抗生素的LB液体培养基中过夜培养，用含有抗生素的MM培养基重新活化；吸取适量的培养物离心去上清，并用頂培养基稀释至OD6tltl = 0.15左右，然后再培养至OD6tltl = 0.5~0.6 ; (9)将第(7)步得到的新鲜孢子配制成悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(8)中的工程农杆菌等体积混合，均匀涂到铺在含CM培养基上的玻璃纸上，进行共培养，之后将玻璃纸反铺到选择培养基上，进行选择培养，然后揭下玻璃纸，等待转化子长出，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，得到所述青霉基因工程菌；其中，CM培养基:加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: (1)利用限制性内切酶将潮霉素抗性表达盒酶切下来，克隆到质粒PCAMBIA2300，获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2302 ； (2)利用高盐低pH方法进行扩展青霉DNA的抽提； (3)以步骤(2)中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增PEL;以质粒pAN7-l为模板扩增TtrpC，然后将PEL和TtrpC进行连接，融合片段经凝胶回收，克隆至pMD18_T载体上，得到载体 PMD18-T::PEL-TtrpC ；(4)以步骤(2)中的扩展青霉基因组DNA为模板，PCR扩增强启动子PgpdP，片段经限制性内切酶消化后克隆至PMD18-T:: PEL-TtrpC，得到含有PEL基因表达盒的载体pMD18_T::PgpdP-PEL-TtrpC ； (5)利用限制性内切酶对载体pMD18-T::PgpdP-PEL-TtrpC进行消化，获得PEL基因表达盒，然后克隆至重组质粒PCHAMBIA2302上，获得含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体 pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC ； (6)将终载体pCHAMBIA2302:: PgpdP-PEL-TtrpC通过冻融法转化工程农杆菌EHA105 ； (7)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，收集成熟孢子； (8)将含终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-PEL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有抗生素的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有抗生素的丽培养基重新活化，28°C，220rpm培养48小时；吸取适量的培养物离心去上清，并用頂培养基洗涤，最后用頂培养基稀释至OD6tlt...

【专利技术属性】
技术研发人员：张田，王剑英，唐克轩，林智，
申请(专利权)人：深圳市绿微康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：