金核霉素的生物合成基因簇及其应用制造技术

本发明专利技术涉及金核霉素的生物合成基因簇及其应用，所述基因簇包括金核霉素生物合成的4个基因，包括anmB、anmC、anmD和anmE。本发明专利技术所提供的基因簇及其编码的蛋白可用于合成金核霉素。本发明专利技术还提供包含所述基因或基因簇的表达载体或宿主细胞，及其在医药、工业或农业等方面的应用。

Biosynthesis gene cluster and application thereof

The present invention relates to a biosynthetic gene cluster and its application in the gene cluster, comprising 4 genes encoding biosynthesis, including anmB, anmC, anmD and anmE. The gene cluster provided by the invention and the protein coded by it can be used for synthesizing clindamycin. The invention also provides an expression vector or a host cell containing the gene or gene cluster, and its application in medicine, industry, agriculture, etc..

【技术实现步骤摘要】
金核霉素的生物合成基因簇及其应用
本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域。具体地说，本专利技术涉及金核霉素的生物合成基因簇及其应用。
技术介绍
金核霉素(aureonuclemycin)是1987年从金色链霉菌苏州变种(Streptomycesaureus var.suzhoueusis n.var Yen et al,中国微生物菌种保藏管理委员会编号CGMCCN0.0122 ;中国专利申请CN87100250)的发酵产物中分离得到的。作为一种优质的农用抗生素，金核霉素得到了广泛的应用。金核霉素及其结构类似物的化学合成已经由Nicholas J.Newcombe与SatoshiIchikawa等人作过深入研究,经过一个核心的由SmI2催化的Aldol反应形成C-糖苷键,实现金核霉素骨架结构的形成，然后经过多步反应实现环化和立体结构控制，生成终产物。化学合成经历的步骤繁琐,试剂复杂昂贵,并且合成过程中立体控制困难。Satoshi Ichikawa等人合成herbicidinB过程中，开始得到的产物并不是目标产物herbicidinB,而是它的异构体，他们经过分析后，改变了策略才成功的得到了 herbicidinB，但是产量很低，不能做为工农业生产用途。上海市农药研究所，经过二十年的努力，通过“试差法”，改变、调整发酵参数，摸索出了适合金核霉素生产的发酵条件，使金核霉素的产量得到了很大提高。但是仍然满足不了农业应用方面对金核霉素大量且质优价廉的要求；通过对其发酵液的HPLC检测，发现在发酵条件下，发酵液中除了金核霉素作为主要产物外，还有一种占很大比例的副产物5-脱氧次黄嘌呤核苷，将它的结构与金核霉素对比，发现其骨架结构与金核霉素具有很大的相似性，而且由于该副产物总是伴随着金核霉素的产生而产生。然而，迄今为止本领域尚未揭示金核霉素合成基因簇。 因此，本领域急需了解金核霉素生物合成相关的基因或基因簇，以便研究金核霉素的生物合成途径，进而通过基因工程和代谢工程手段提高金核霉素产量。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供涉及金核霉素的生物合成基因簇，及其克隆、功能研究和应用。在第一方面，本专利技术提供一种金核霉素生物合成基因的集合，所述基因集合由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、和编码AnmE蛋白的基因构成。在一优选例中，所述的AnmB蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmC蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmD蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；和所述的AnmE蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。在第二方 面，本专利技术提供一种金核霉素生物合成基因簇，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4个基因，所述基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位碱基所示，具体为:I)基因anmB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-6964位碱基所示，编码的蛋白为腺苷高半胱氨酸水解酶，长度为556个氨基酸；2)基因anmC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第6957-8057位碱基所示，编码的蛋白为脱氢酶，长度为366个氨基酸；3)基因anmD，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第8054-9172位碱基所示，编码的蛋白为氧化还原酶，长度为372个氨基酸；和4)基因anmE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第9169-10434位碱基所示，编码的蛋白为radical SAM相关蛋白，长度为421个氨基酸。在第三方面，本专利技术提供本专利技术第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇所编码的编码蛋白。在一优选例中,所述的编码蛋白为AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID N0:3-6所示。在第四方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇，或第三方面所述的编码蛋白的用途，其用于合成抗生素金核霉素、金核霉素的药学上可接受的盐及类似物。在另一优选例中，所述的合成包括生物合成、催化合成、固定化酶合成。在第五方面，本专利技术提供一种载体，所述载体含有第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或含有第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。在一优选例中，所述表达载体上含有多拷贝的金核霉素生物合成基因的集合，或多拷贝的金核霉素生物合成基因簇。在另一优选例中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体。在另一优选例中,所述的载体包括质粒、或粘粒。在第六方面，本专利技术提供一种重组的宿主细胞，含有第五方面所述的载体或染色体上整合有单拷贝或多拷贝的外源的第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或单拷贝或多拷贝的第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。 在另一优选例中，所述宿主细胞包括链霉菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。在另一优选例中，所述宿主细胞包括金色链霉菌、变铅青链霉菌、白色链霉菌和天蓝色链霉菌。更佳地，所述宿主细胞来自金色链霉菌苏州变种或变铅青链霉菌TK64。在第七方面，本专利技术提供一种产生金核霉素的方法，包括步骤:培养第六方面所述的宿主细胞，从而表达金核霉素；以及从培养体系中分离金核霉素。在第八方面，本专利技术提供一种金色链霉菌，所述金色链霉菌是金色链霉菌苏州变种(CGMCC N0.0122)的突变株，所述突变株中金核霉素生物合成基因簇中的一个或多个基因失活，从而不产生金核霉素。在另一优选例中，所述失活的基因选自anmB、anmC, anmD或anmE。在另一优选例中，所述的失活包括中断失活、缺失失活、插入失活。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。【附图说明】下列附图用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术范围。图1显示了金核霉素的化学结构。图2显示了基因组文库黏粒的PCR筛选电泳图。各泳道如下:M:分子量标准；1:包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒2H-2 ；2:包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒17C-10。图3显示了金核霉素生物合成基因簇的基因分布图。图4显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金核霉素生物合成基因的集合，其特征在于，所述基因集合由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、和编码AnmE蛋白的基因构成。

【技术特征摘要】
1.一种金核霉素生物合成基因的集合，其特征在于，所述基因集合由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、和编码AnmE蛋白的基因构成。2.如权利要求1所述的基因的集合，其特征在于， 所述的AnmB蛋白包括选自下组的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID N0:3所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽； 所述的AnmC蛋白包括选自下组的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID NO:4所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽； 所述的AnmD蛋白包括选自下组的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID NO:5所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；和 所述的AnmE蛋白包括选自下组的多肽: (a)氨基酸序列如SEQID NO:6所示的多肽；或 (b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。3.一种金核霉素生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4个基因，所述基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位碱基所示，具体为: 1)基因anmB，其核苷酸序列如SEQID NO:1的第5294-6964位碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐功利，李玮涛，潘海学，蹇晓红，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：