芍药2-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因及其编码产物和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因及其编码蛋白与用途，该基因为首次利用构建cDNA文库从芍药中克隆而得，填补了从我国传统中药材芍药中分离克隆出2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶基因的空白。本发明专利技术所提供的2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因具有SEQ?IDNO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明专利技术提供的2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因可以通过生物技术提高芍药中4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸代谢产物的含量，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因及其编码产物和应用
本专利技术属于生物
，主要涉及利用芍药cDNA文库克隆2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶基因及其编码产物与应用，尤其涉及生物合成有药理活性成分的有机酸、萜类酶基因及其编码产物与应用，属于药用植物基因工程领域。
技术介绍
药用植物活性成分的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。药用植物的化学成分复杂，种类繁多，其中主要含有有机酸类、黄酮类、挥发油、萜类、二萜类、微量元素等多种成分，芍药Paeonia lactif 1ra不仅是名花,还是一味常用中药,其根可供药用。其中白苟具有镇痉、镇痛、通经等作用。芍药根中含有芍药苷、安息香酸等活性成分，其中芍药苷属于单萜类化合物，具有显著的镇痛、镇静、抗惊厥、，解痉、解热、抗炎、抗溃疡、抗过敏、降血糖、调节免疫、保护肝脏等作用(杨俊，方红编。芍药[M]。北京:中国中医药出版社，2001，113)。2_ 甲基-D-赤藓醇-2,4-环二憐酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase, IspF)是位于质体中的職类化合物的脱氧木酮糖_5_磷酸途径(DXP)中的关键酶基因，其表达量可能与芍药苷等萜类成分的含量密切相关。IspF能催化4-二憐酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-憐酸(2-Phospho_4-(cytidine 5' -diphospho)-2-C-methyl-D-e·rythritol, CDP-ME2P)生成 2_C_ 甲基-D-赤藓醇 2,4 环二憐酸(2-C-Methyl-D-erythri to 12,4-cyclodiphosphate, ME_2,4CPP)和 CMP,再经过 1-轻基-2-甲基-2-(E)_ 丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、异戊烯基单磷酸激酶(IPK)的作用生成异戊烯基焦磷酸(IPP)或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，再进一步合成各种不同的萜类化合物(张长波，孙红霞，巩中军，祝增荣。植物萜类化合物的天然合成途径及其相关合酶[J]。植物生理学通讯，2007，43 (4):779-786)。芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因的克隆，为利用基因工程提高芍药活性成分含量提供重要基础，在药材芍药的品质改良、活性成分合成生物学等方面，具有很好的应用前景。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶基因及其氨基酸序列。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4_环二磷酸合酶(PLIspF)基因。本专利技术第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。本专利技术还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。本专利技术的另一个目的在于提供该基因的应用。本专利技术所提供的芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因，为以下核苷酸序列之一:(I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；(2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。该基因所编码的蛋白质为芍药2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因，是以下氣基酸序列之一:(I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本专利技术所提供的2-甲基-D-赤藓醇-2，4_环二磷酸合酶(PLIspF)基因是首次从芍药中克隆制备的，体外实验表明，I spF能催化4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-憐酸(2-Phospho_4-(cytidine 5 1 -diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol,CDP-ME2P)生成 2-C-甲基-D-赤藓醇 2，4 环二磷酸(2-C-Methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate,ME-2,4CPP)和CMP的活性。利用本专利技术可以通过基因工程技术来提高芍药等植物中萜类物质含量。【附图说明】:图1:PLIspF功能 域预测分析(来源于NCBI数据库)；图2 =PLIspF系统进化树(邻接法)；图3:表达载体pTrc-PLIspF构建；【具体实施方式】实施例1、芍药cDNA文库的构建1、芍药总RNA的分离和检测取苟药(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研钵中用液氮快速研磨成粉末,快速转移至 65°C预热的 IOmL 提取缓冲液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol ? L' EDTA25mmol ? L' NaCl 2.0mol ? I71，PVP402%，亚精胺 0.5g/L，巯基乙醇 2% )，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的IOM LiCl，混匀后放置 4°C沉淀过夜；7500g 离心 20 分钟，沉淀用 500iiL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol ? I71，Tris-HCl (pH8.0) IOmmol ? L' EDTA lmmol ? I71，在 65°C溶解 5 分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，_70°C放置2小时；4°C 13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于IOOiI L DEPC处理的水中，用1.0%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于_80°C冰箱备用。2、cDNA文库的构建米用mRNA 纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分离 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Ca.N0.634903)进行建库，原理为 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。实施例2:芍药相关基因的克隆随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的IOul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次加入:Taq buffer 2.5 y L，MgCl2 (25mM) 1.8 y L，dNTP (2.5mM) I y L，M13+引物(IOpmol) I u L，M13-引物(IOpmol) I u L，Taq SI 0.4 u L0 PCR 反应条件为 94°C预变性 5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种2?甲基?D?赤藓醇?2，4?环二磷酸合酶(PLIspF)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一：(1)SEQ?ID?No.1的DNA序列；(2)SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种2-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(PLIspF)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。2.—种2-甲基-D-赤藓醇-2，4-...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄璐琦，袁媛，汪周勇，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：