本发明专利技术属于涉及一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）Gluconobacterkondonii，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCCNo.8391。本发明专利技术还给出了利用该菌株发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其在好氧条件下能显著地积累L-赤藓酮糖，最高达到186.5g/L，可实现工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385和方法
本专利技术属于生物制造领域，具体涉及到一种好氧微生物发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖用的菌株HD385和利用该菌株发酵生产赤藓糖醇的方法。
技术介绍
L-赤藓酮糖是一种天然的丁酮糖，是赤藓糖的酮糖形式。其分子式是C4H8O4,分子量为120.10，英文名称:L-erythrul0Se，是一种黄色高粘稠液体，有甜味。L-赤藓酮糖可以与皮肤外部或老死表层中的角蛋白氨基酸发生反应，使皮肤变成棕色而作为自然仿晒试剂，同时它也是多种抗感染药物的前体化合物。其主要用途是用于化妆品行业，一般用作美黑剂。与二羟基丙酮相比较，其美黑效果更佳持久、自然；如果和二羟基丙酮配合使用，使颜色加深，分布更为均匀。L-赤藓酮糖的工业化生产主要是利用含有赤藓糖醇脱氢酶微生物以赤藓糖醇为底物发酵生产。报道最多的能产L-赤藓酮糖的微生物为葡萄糖酸杆菌属iGluconobacter)和醋杆菌属iAcetobacter)。目前已报道的能产L-赤藓酮糖的微生物资源如下:Gluconobacter oxydans ATCC621、Gluconobacter oxydans DSM7145、Gluconobacterfrateurii CHM43、GluconobactermeIanogenus ?Μ61387Λ Acetobacter suboxydans、Acetobacter xylinum等。国内外关于产L-赤藓酮糖的微生物资源及微生物生产报道较少，且很多菌株的转化率都较低，例如利用Gluconobacter oxydans ATCC621生产L-赤藓酮糖时对底物的转化率仅为45~50%。因此，自主创新地筛选出能够耐受高浓度赤藓糖醇的微生物菌株，并且研究出一种能够生产高浓度L-赤藓酮糖的方法迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种对高浓度赤藓糖醇有一定耐受性的菌株HD385，该菌株可用于微生物发酵生产L-赤藓酮糖。本专利技术还给出了利用该菌株HD385发酵生产L-赤藓酮糖的方法，该方法以赤藓糖醇为原料，赤藓糖醇转化率较高。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: 一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385,其分类属醋酸杆菌科(Ace tobac teraceae )葡萄糖酸杆菌属(Gluconobac ter ) Gluconobac ter kondonii，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.8391 ;保藏日期为2013年10月24日；保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。利用所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，具体为:将菌株HD385按I~10%的接种量接入液体发酵培养基，在好氧条件下于28~30°C发酵培养48~72 h ;所述液体发酵培养基组成为:赤藓糖醇50~250 g/L,氮源6~20 g/L,碳酸|丐0.1~15 g/L, KH2PO4 0.1~8 g/L，余量为水，培养基pH 4~7。或者，也可以将菌株HD385先按I~10%的接种量接种到一级种子培养基中，于28~30°C好氧培养6~24 h ;然后将培养好的一级种子按I~10%的接种量接入二级种子培养基中， 8~10 h后将培养好的二级种子按I~10%的接种量再接入液体发酵培养基；其中，所述一级种子培养基的组成为:赤藓糖醇10~50g/L,酵母粉5~15g/L, KH2PO4 0.1~0.5g/L，余量为水，pH自然；所述二级种子培养基的组成为:赤藓糖醇10~50g/L，酵母粉5 ~15g/L, CaCO3 0.1 ~0.5g/L，余量为水，pH 4.0 ~7.0。具体的，所述赤藓糖醇优选为食品级赤藓糖醇、医药级赤藓糖醇等。所述氮源优选为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆、尿素或无机铵盐等。可通过本领域的常规方法来调节培养基的pH值，如添加盐酸、氢氧化钠等无机酸碱。其中，所述液体发酵培养基、一级种子培养基和二级种子培养基的灭菌条件为:107~121。。，15 Hiin0在本专利技术中，建立了一个筛选高产L-赤藓酮糖的模型。由于具有赤藓糖醇脱氢酶的微生物能利用赤藓糖醇做为碳源生长，并产生L-赤藓酮糖，因此设计出以赤藓糖醇为唯一碳源的选择性平板，筛选出能够利用赤藓糖醇的菌株。在平板上挑出较大的菌落至摇瓶，液体发酵筛选。本专利技术的特点是从腐烂的蔬菜中分离得到能有效产生L-赤藓酮糖的Gluconobacter Ao/7i/o/?iiHD385,其在好氧条件下能显著地积累L-赤藓酮糖(40 — 186 g/L)，最高达到186 g/L，可实现工业化生产。本专利技术方法的突出优点是利用廉价的赤藓糖醇为原料来发酵生产高附加值产品L-赤藓酮糖，该方法可持续生产，且对环境友好。【附图说明】图1 为 Gluconobacter kondoniiHD385 的平板菌落照片； 图 2 为 Gluconobacter kondoniiHD385 的扫描电镜照片(X5000)； 图 3 为 Gluconobacter kondoniiHD385 的 16S rDNA 全序列测序结果； 图4为基于BLAST结果构建的进化树。【具体实施方式】(一) Gluconobacter kondoniiYS)?>Sh 的筛选: 1、初筛: 从腐烂的蔬菜中取样，粉碎后，取10 g加入90 mL无菌生理盐水，振荡I h，取上清液，稀释成一系列浓度梯度。取10_5、10_6、10_7三个梯度0.2 mL涂布于平板培养基(平板培养基组成为:赤藓糖醇150 g/L，酵母粉15 g/L，琼脂粉15 g/L, KH2PO4 lg/L，余量为水，pH自然)，28°C培养:3-4 d，获得单菌落。选取菌落均匀的平板，从其上挑取10 — 20个较大菌落分别接种至发酵培养基(每株菌株做一个摇瓶，发酵培养基组成为:赤藓糖醇100 g/L，酵母粉10 g/L, CaCO3 3 g/L，余量为水，pH自然)，28°C发酵培养48 h。然后取1.5mL发酵液12000转/分离心5 min，取上清液，稀释后用HPLC法测定L-赤藓酮糖含量。HPLC条件如下:色谱柱Aminex ]^^)(-87(]柱(7.8 mmX300 mm,9 μ m)；流动相:去离子水；检测器:RI检测器，UV检测器(检测波长277 nm);柱温60°C ;流速0.4ml/min ;进样量 20 μ I。选取产L-赤藓酮糖较高的百余株菌株，于4°C条件下保存其相应斜面(斜面培养基组成为:赤藓糖醇30 g/L，酵母粉15 g/L，琼脂粉15 g/L,KH2PO4 I g/L，余量为水，pH自然，赤藓糖醇为食品级)。、复筛: 将初筛保留的菌株转接于装有30 mL发酵培养基的三角瓶中(每株菌株做三个摇瓶平行样，发酵培养基组成与初筛中的发酵培养基相同)，200转/分，28°C好氧培养48 h。取1.5mL发酵液12000转/分，离心5 min,取上清液，稀释后用HPLC法测定L-赤藓酮糖含量。多数菌株L-赤藓酮糖含量较低，仅有3-8-5号菌株(实验室该菌株编号为HD385)产L-赤藓酮糖显著,为64.9 g/L。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微生物发酵生产L‑赤藓酮糖的菌株HD385，其分类属醋酸杆菌科（Acetobacteraceae）葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）Gluconobacter kondonii，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8391。
【技术特征摘要】
1.一种微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385,其分类属醋酸杆菌科(Acetobacteraceae )葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter ) Gluconobacter kondonii，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.8391。2.利用权利要求1所述菌株HD385发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于:包括如下步骤:将菌株HD385按I~10%的接种量接入液体发酵培养基，在好氧条件下于28~30°C发酵培养48~72 h ;所述液体发酵培养基组成为:赤藓糖醇50~250 g/L，氮源6~20 g/L，碳酸钙0.1~15 g/L, KH2PO4 (λ1~8 g/L，余量为水，培养基pH 4~7。3.根据权利要求2所述发酵赤藓糖醇生产L-赤藓酮糖的方法，其特征在于，将菌株HD385先按I~...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱龙华，刘宇鹏，李柱坚，潘龙，靳魁奇，朱晓宏，
申请(专利权)人：深圳市博大生物技术有限公司，河南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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