花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用。本发明专利技术在花生中分离获得SOS家族基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ?NO.1所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本发明专利技术对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对基因在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对花生进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新花生抗逆新种质，具有指导作用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用。本专利技术在花生中分离获得SOS家族基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ?NO.1所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本专利技术对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对基因在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对花生进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新花生抗逆新种质，具有指导作用。【专利说明】花生抗盐基因AhS0S2、克隆方法及应用
本专利技术属于基因工程
，具体说，涉及克隆花生中抗盐的AhS0S2基因并利用其构建融合表达载体，进而通过转基因途径改变植物性状的方法及应用。
技术介绍
盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型，我国盐碱土地主要分布在东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带。土壤盐害即盐胁迫，主要表现为渗透胁迫，通过破坏细胞的正常离子分布和动态平衡，干扰植物细胞内的各种代谢过程，最终造成植物的伤害甚至死亡，对作物的产量和品质均有重要的影响。然而，随着人口增加和耕地减少，地球表面大面积盐碱地资源的开发利用具有极其重要的现实意义。因为绝大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3%以下的土壤中，这极大的限制了植物在盐碱滩地上的生长。目前，对植物抗盐、抗逆机制的研究及培育作物抗逆新品种已成为广大植物学家和育种学家研究的主要任务之一。以围绕抗逆基因对植物在逆境环境下的作用为主的研究，已成为从系统水平上探索胁迫生物学和提高植物胁迫抗性和耐性的有效手段。在盐胁迫条件下，大量的盐分进入植物细胞，造成Na+离子毒害和细胞失水，破坏了植物细胞中稳定的Na+、Cl—平衡，也影响K+的吸收和Ca2+等离子在胞内的分布，从而影响细胞内的生理调节、信号传导等一系列途径。盐害引起的渗透胁迫，以及由此产生的营养亏缺和次级氧化胁迫，还造成了植物细胞内活性氧的过量积累。大量的活性氧可引起细胞膜脂和蛋白质的过氧化，从而造成生物大分子损伤、代谢途径紊乱，导致植物生长停滞甚至死亡。盐胁迫下，细胞内的离子平衡的调节对于植物的耐盐性十分重要。离子平衡的建立在细胞水平上主要包括两方面=Na+的外排和Na+的区隔化。Na+外排主要由细胞质膜Na+/H+逆向转运蛋白(如:S0Sl,Salt Overly Sensitivel)利用质子泵供能将细胞内的Na+排到胞外而完成。Na+的区隔化主要是液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(如:NHX1)起作用，通过质子泵水解ATP供能，将胞质中的Na+区隔化至液泡内。Na+的外排和Na+的区隔化减少了Na+在细胞内的积累，同时促进K+的高亲和性吸收，这对维持植物细胞内K+和Na+的稳态平衡，维持稳定的PH值和离子稳态起着重要的作用。美国朱健康实验室最先从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现了参与介导盐胁迫下细胞内Na+的外排及向液泡内的区隔化的相关因子。通过快中子轰击(fast neutronbombardment)、T-DNA诱变以及化学突变(如EMS诱导)等方法，他们创制了大量的拟南芥突变植株，从中筛选并获得了 5组盐敏感突变体，并进一步鉴定了 5个相关基因，因以上基因均在同一信号通路中，故命名为SOS家族(Salt Overly Sensitive)，其成员即包括AtSOSU AtS0S2、AtS0S3、AtS0S4和AtS0S5。 之后该家族相关成员在其他物种中也均有报道。其中S0S2类基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其N-末端催化位点与酵母SNFl激酶和哺乳动物的AMPK激酶非常相似，正常情况下，该基因在植物体内含量很低，但盐胁迫下，其在拟南芥根中表达量明显上调。植物在受到高盐胁迫时，会打破体内的离子平衡，Qiu等通过检测拟南芥突变植株与野生型植株细胞内Na+和H+含量，证明了SOS信号通路对于植物抗盐过程具有不可替代作用，S0S3是一个Ca2+感受器，能够激活体内的S0S2蛋白激酶，并与S0S2结合形成S0S3-S0S2蛋白激酶复合物，通过磷酸化激活SOSI，使细胞膜上的Na+/H+逆向转运蛋白发挥作用，将体内的Na+排出体外(Qiu QS，Guo Y, Dietrich MA, Schumaker KS, Zhu JK.Regulation of SOSI, a Plasma MembraneNa+/H+Exchanger in Arabidopsis thaliana, by S0S2and S0S3.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 2002,99:8436-8441.)。Quan等通过质壁分离和GFP染色技术证明了 S0S3的同系物SCABP8/CBL10与S0S2蛋白激酶相互作用提高拟南芥芽组织的耐盐性，并且SCABP8与S0S2共同激活 SOSl 发挥作用(Ruidang Q, Huixin L, Imelda M, Yuguo Z, Wanhong C, YongqingY, Mei S，Shouyi C，Jose1 M.Pardo, and Yan G, SCABP8/CBL10, a Putative CalciumSensor,Interacts with the Protein Kinase S0S2to Protect Arabidopsis Shoots fromSalt Stress.The Plant Cell, 2007，19:1415-1431.)。目前已经从陆地棉、芥菜及大豆中得到了与拟南芥中的S0S2序列上同源、功能上相同或者相似的基因。这些研究结果表明S0S2基因在植物界中是广泛存在的，并且在不同的植物中，它们执行着相似或者相同的功能。拟南芥AtSOSl、AtS0S2和AtS0S3同时在拟南芥中表达显著提高了转基因植株的耐盐性，在酵母中，同时表达SOSl，S0S2和S0S3大大提高了酵母的耐盐性，其耐盐性比只表达其中一个蛋白有更加明显的提高，进一步证明SOSl依赖S0S2和S0S3的调节，以介导Na+外排，在植物耐盐中起到重要的作用。花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油用兼食用作物,其产量和品质与人类生活密切相关。花生主要生长于干旱和半干旱地区，是一种较耐旱作物，能忍耐极低的叶片水势，叶片水势降到_45Pa时，植株仍能维持生命力。花生在应对恶劣环境中选择性的积累了胁迫抗性基因，然而对花生分子生物学研究进展却很有限，关于花生耐盐胁迫及其在离子稳态调节方面的研究则更少。虽然模式植物拟南芥中的SOS信号途径研究较清楚，但对该途径在其他物种如何参与抗盐、耐盐及相关机制的了解还较少。本专利技术在花生中分离获得SOS家族基因AhS0S2，并通过构建相应的植物表达载体转化水稻对基因抗盐及抗逆功能进行了验证，该方面工作的开展有助于加深对SOS途径及其在植物抗盐方面的认识和了解，为改良及培育植物抗盐及抗逆新品种提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术提供了克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
花生抗盐基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ?NO.1所述。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炜，张国嘉，王庆国，李臻，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：