一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过理性设计，在木聚糖酶xyn-CDBFV的N端结构域和催化中心之间设计引入7位/217位和11位/45位二硫键，即得到重组木聚糖酶xyn-LVK，在xyn-LVK中，N端结构域和催化中心之间有三个二硫键，它们使N端结构域这个“夹子”更稳固的夹住催化中心，使突变酶在高温下更加稳定。将xyn-LVK在毕赤酵母中表达后，与木聚糖酶xyn-CDBFV相比，突变后的酶的热稳定性得到了明显的提高，在90℃处理4min还能保留65％的酶活，处理8min后还有42％的剩余酶活性。

A xylanase with improved thermostability and xyn-LVK and its genes

The invention discloses an improved thermal stability of xylanase xyn-LVK, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.1. The present invention through rational design, the xylanase xyn-CDBFV N N-terminal domain and the catalytic center design into 7 bit /217 and 11 bit /45 two disulfide bonds, to obtain the recombinant xylanase xyn-LVK, in xyn-LVK, three of two disulfide bonds between N domain and the catalytic center, which make the N terminal domain between the catalytic center this \clip\ is more stable, the mutation enzyme is more stable at high temperatures. The expression of xyn-LVK in Pichia pastoris, compared with xylanase xyn-CDBFV, mutated enzyme thermal stability were improved obviously, 90 degrees in the treatment of 4min can retain 65% of the enzyme activity, residual enzyme activity and 42% 8min after treatment.

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因
本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因。
技术介绍
木聚糖酶在许多工业中被广泛应用，如饲料行业、造纸行业和食品行业。然而，在这些应用中，往往需要酶具有良好的耐热性，宽广的pH和较高的比活。所以，人们不断去寻找新的具有优良性能的可用木聚糖酶，并通过随机突变或者理性设计方法来提高它的性能。其中，来源于瘤胃真菌（Neocallimastixpatriciarum）的木聚糖酶催化结构域xyn-CD，通过易错PCR将其随机突变得到的重组木聚糖酶xyn-CDBFV（其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，基因序列如SEQIDNO.6所示）拥有较高的酶活、较宽的pH和良好的耐热性。因此，重组木聚糖酶xyn-CDBFV在工业产品中具有广泛的应用前景。目前，Cheng,Y.S等详细解析了该蛋白的结构，并结合实验提出了该蛋白的耐热因素（Cheng，Y.S.etal.（2014）StructuralAnalysisofaGlycosideHydrolaseFamily11XylanasefromNeocallimastixpatriciarum:InsightsintotheMolecularBasisofaThermophilicEnzyme.J.Biol.Chem.）。xyn-CDBFV具有11家族木聚糖酶典型的β-jelly-roll折叠结构，但是xyn-CDBFV具有延伸出来的N端结构域（N-terminalregion，NTR），这在11家族木聚糖酶结构中是罕见的。NTR是依靠堆积相互作用、氢键和一个二硫键稳定的附着在xyn-CDBFV的催化中心，而不是做为一个灵活的片段自由地悬挂在外面。Cheng，Y.S等的研究表明：仅删除由11个氨基酸组成的NTR后，xyn-CDBFV突变株的酶活在55℃和75℃分别降为原来的61.5%和19.5%；仅删除由NTR和催化中心形成的二硫键后，xyn-CDBFV突变株的酶活在55℃和75℃分别降为原来的86.8%和23.3%。由此可见，NTR在该酶热稳定性中有着重要作用，尤其是NTR和催化中心形成的二硫键更是起着关键作用，在二硫键的作用下，NTR像个夹子一样夹住催化中心，使它在高温下能稳定。中国专利CN102757947公开了一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因，其中，对木聚糖酶xyn-CDBFV的改良之一是将33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分别替换为半胱氨酸，并称其是在木聚糖酶xyn-CDBFV的N端引入二硫键。但随着Cheng，Y.S等解析了木聚糖酶xyn-CDBFV蛋白的晶体结构，发现其NTR仅由11个氨基酸组成，因此，对于中国专利CN102757947中公开的的N端引入二硫键提高木聚糖酶xyn-CDBFV的热稳定性的结果值得怀疑，因为33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸并非位于木聚糖酶xyn-CDBFV的N端结构域。
技术实现思路
在了解了NTR和催化中心形成的二硫键的重要性后，本专利技术的目的是通过改造木聚糖酶xyn-CDBFV，使改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在高温时的稳定性大大提高。具体地，本专利技术通过DisulfidebyDesign软件对xyn-CDBFV上的二硫键进行了在线分析预测。经分析，存在26个可以形成二硫键的潜在位点。它们分别是：4位/172位；7位/217位；7位/218位；11位/45位；28位/65位；29位/42位；50位/60位；55位/58位；57位/204位；61位/198位；70位/74位；83位/172位；83位/218位；91位/208位；95位/117位；95位/118位；97位/115位；100位/200位；102位/195位；129位/145位；131位/143位；141位/164位；176位/179位；184位/189位；199位/219位；205位/208位。其中，NTR和催化中心之间除了已形成的4位/172位二硫键外，还有7位/217位和11位/45位可以设计形成二硫键。结合预测结果，理性的在NTR和催化中心之间设计引入7位/217位和11位/45位二硫键，这样在木聚糖酶xyn-LVK中，NTR和催化中心之间将有三个二硫键，它们使NTR这个“夹子”更稳固的夹住催化中心，使木聚糖酶xyn-LVK在高温下更加稳定。本专利技术的一方面是提供一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述SEQIDNO.1的序列如下：QSFCSSCSHSCQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWADSGNNSATFYScGSFSCTFQNAGDYLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQNSSNVGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPPGDWVGNKKHGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIDISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFcYAKVYIGD。本专利技术中，将SEQIDNO.1所示的木聚糖酶的氨基酸序列命名为木聚糖酶xyn-LVK。本专利技术的木聚糖酶xyn-LVK和原有木聚糖酶xyn-CDBFV相比，有4个氨基酸发生了突变，突变位点分别是A7C，G11C，D45C，P217C。本专利技术的另一方面还涉及一种热稳定性改良的木聚糖酶基因xyn-LVK，其编码上述木聚糖酶xyn-LVK，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述SEQIDNO.2的序列如下：CAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn‑LVK，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种热稳定性改良的木聚糖酶基因xyn-LVK，其特征在于，其编码权利要求1所述的木聚糖酶xyn-LVK。3.根据权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-LVK，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.包含权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-LVK的表达载体。5.包含权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-LVK的表达载体pPIC9K-xyn-LVK，将木聚糖酶基因xyn-LVK插入到质粒pPIC9K的信号肽序列的下游并受其调控，得到重组表达质粒pPIC9K-xyn-LVK。6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求2所述的木聚糖酶基因xyn-LVK或权利要求4所述的表达载体或权利要求5所述的重组表达质粒，所述重组菌株为重组大肠杆菌菌株或重组毕赤酵母菌株。7.一组引物对，所述引物对用于对木聚糖酶基因xyn-LVK的成熟蛋白的编码区进行扩增，所述引物对的两条引物分别为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所述的序列。8.一种产热稳定性改良的木聚糖酶xyn-LVK的毕赤酵母基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）合成木聚糖酶xyn-LVK基因序列；（2）将所述木聚糖酶xyn-LVK基因序列克隆至pPIC9K中，得到重组表达质粒；（3）将所述重组表达质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备所述重组表达质粒；（4）抽提所述重组表达质粒，用限制性内切酶BglII进行线性化的重组表达质粒电击转化酵母GS115感受态细胞，涂布于组氨酸缺陷型的RDB平板，培养2～3天；（5）用灭过菌的牙签从长有转化子的RDB平板上挑取单菌落，按照编号先点到MM平板上，再点到相应编号的MD平板上，将点有转化子的MM、MD平板置于培养箱中培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王剑英，郭宏涛，白孟飞，吴亚宁，谭福建，
申请(专利权)人：深圳市绿微康生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44