一种芦笋低聚糖的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，步骤为：（1）制备芦笋干粉；（2）加水，重复冻结解冻；（3）浸泡，微波处理；（4）加水混合，浸提，抽滤，浓缩滤液；（5）加入木瓜蛋白酶分解蛋白质；（6）将步骤（5）获得的产物与有机溶剂混合，震荡，离心，去沉淀得上清；（7）将上清液醇沉，离心，沉淀冷冻干燥，得芦笋粗多糖浓缩液；（8）过中性SephadexG-10柱，收集体积为1～2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得芦笋低聚糖。本发明专利技术方法提高了芦笋低聚糖提取效率；并用木瓜蛋白酶+Sevag法除蛋白，蛋白清除率高，粗糖损失率小；分离组分中不含杂质，分离条件温和、设备简便经济、流程简单、能耗低。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，步骤为：（1）制备芦笋干粉；（2）加水，重复冻结解冻；（3）浸泡，微波处理；（4）加水混合，浸提，抽滤，浓缩滤液；（5）加入木瓜蛋白酶分解蛋白质；（6）将步骤（5）获得的产物与有机溶剂混合，震荡，离心，去沉淀得上清；（7）将上清液醇沉，离心，沉淀冷冻干燥，得芦笋粗多糖浓缩液；（8）过中性SephadexG-10柱，收集体积为1～2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得芦笋低聚糖。本专利技术方法提高了芦笋低聚糖提取效率；并用木瓜蛋白酶+Sevag法除蛋白，蛋白清除率高，粗糖损失率小；分离组分中不含杂质，分离条件温和、设备简便经济、流程简单、能耗低。【专利说明】
本专利技术属于低聚糖的制备
，涉及一种具有抗氧化、调节肠道菌群作用的芦笋低聚糖的分离纯化方法 。
技术介绍
低聚糖(Oligosaccharide)又名寡糖,是指有三个或三个以上的单糖通过糖苷键聚合在一起(聚合度< 10),形成支链状、分支链状或环状的、经水解后分解为以单糖为单位的碳水化合物，构成低聚糖的单糖主要有五碳糖和六碳糖，如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖等。一些植物中低聚糖的含量较高，如大豆饼柏中的棉籽糖和水苏糖，甜菜糖蜜中含有棉籽糖，有研究报道，芦笋、地黄、大蒜、洋葱、牛蒡、香蕉、野西瓜等植物中都有低聚糖的存在。大量研究已表明低聚糖具有改善人体内微生态环境，调节肠道菌群、润肠通便、调节血脂、调节免疫等作用。其最显著的特征是能使人体内的双歧杆菌迅速繁殖，改变肠道中菌群比例，保持良好的肠道环境。芦笋低聚糖具有还原性的半缩醛羟基，可以捕获脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进行。芦笋低聚糖可以与O2^发生氧化反应来清除超氧阴离子自由基。芦笋低聚糖对羟基自由基的清除效率很高，是良好的自由基清除剂。芦笋低聚糖可以促进肠道双歧杆菌的生长，抑制肠道大肠杆菌的生长，而双歧杆菌会产生抑菌素增强抑制大肠杆菌的作用，进而起到调节和纠正肠道内菌群紊乱，促进肠道蠕动，润肠通便，防治便秘等作用。芦笋低聚糖是一种优良的天然抑菌因子，能够促进益生菌的增殖，同时抑制有害菌的繁殖，对于调节肠道菌群平衡有重要的作用。对于低聚糖分离纯化方法的研究多见于大豆、地黄、魔芋、牛蒡等植物中，目前还没有关于芦笋低聚糖分离纯化方法的报道。从植物中提取低聚糖一般采用水浸提取、碱液提取、膜分离技术等，水浸提取效率很低，碱液提取有效成分含量高但时间太长，膜分离技术设备投资大，工艺复杂，并不适合工业化生产，目前低聚糖提取工艺的研究主要集中在提取辅助技术、设备的改进和生产工艺技术的改善方面。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种过程简单，能耗低的芦笋低聚糖的分离纯化方法。本专利技术的技术方案概述如下:，包括下述步骤:( I)将速冻芦笋破碎，冷冻干燥，粉碎，过30~100目筛，得到芦笋干粉；(2)向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量10~30倍的水，在-30~-18°C冻结6~12h，微波解冻；重复冻结解冻I~2次；(3)将步骤(2)获得的产物在常温下浸泡I~3h，在微波功率为100~300W，处理5 ~15min ；(4)按质量比为1:5~40的比例，将步骤(3)获得的产物加水混合，在50~100°C浸提30~150min，抽滤，重复浸提I~4次，合并滤液，浓缩至滤液体积的1/5-1/3 ；(5)向步骤(4)获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使浓度为20万~30万u/L，40~60°C揽祥4~6h ;(6)将步骤(5)获得的产物与有机溶剂按体积比为4~6:1混合，震荡20~30min，3500~5000r/min离心10~20min，去除蛋白质沉淀，得到上清液，重复加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；所述有机溶剂是体积比为4~6:1的氯仿和正丁醇混合液；(7)向步骤(6)获得的上清液中加入2~4倍体积的体积浓度为95%的乙醇水溶液，4°C醇沉8~12h，将醇沉后的提取液在3500~5000r/min离心10~20min，依次用乙醇、乙醚和丙酮洗涤沉淀1-3次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液；(8)将浓缩液过中性SephadexG-1O柱,调节螺动泵转速为2~3r/min,进样体积为0.4~1.0mL,收集体积为I~2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得到芦笋低聚糖。 本专利技术采用工艺较为简单，适用性强的水浸提法并加以改进。通过水浸提取与醇沉、融冻破壁和微波法相结合，大大提高了芦笋低聚糖的初步分离效率；采用木瓜蛋白酶+Sevag法除蛋白，蛋白脱除率高,粗糖损失量小；利用SephdexG-1O可以较好地分离出芦笋粗多糖提取物中的低聚糖成分，产物经纯度鉴定，分离组分中不含淀粉、蛋白质、核酸等杂质，纯度可达96%。本专利技术所提出的分离纯化方法分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便、流程简单、能耗低、可以连续循环操作，易于工业化生产。利用GPC-MwA-DNDC联用技术对芦笋低聚糖的分子量进行测定，两种芦笋低聚糖的分子量分别为524.566和568.615，推断其为三糖或者四糖。最后通过红外光谱对其结构进行验证。从芦笋中分离低聚糖并测定其结构的方法。该方法过程简单，能耗低。分离得到的芦笋低聚糖是一种天然的自由基清除剂和抗氧化剂，作为益生元可以促进肠道双歧杆菌的生长，抑制肠道大肠杆菌的生长，进而起到维持肠道菌群平衡的作用。【专利附图】【附图说明】图1为芦笋低聚糖层析图谱。图2为芦笋低聚糖分子量GPC图谱。图3为芦笋低聚糖红外光图谱。图4为芦笋低聚糖气相色谱图。图5-1为芦笋低聚糖组分I质谱图。图5-2为芦笋低聚糖组分2质谱图。图6为芦笋低聚糖体外清除.0H自由基的能力。图7为芦笋低聚糖体外清除超氧阴离子自由基的能力。【具体实施方式】本专利技术的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本专利技术，并不能对本专利技术作任何限制。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1，包括下述步骤:(1)将速冻芦笑破碎,冷冻干燥,粉碎,过60目筛，得到芦笑干粉；(2)向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量20倍的水，在_20°C冻结8h，微波解冻；重复冻结解冻I次；(3)将步骤(2)获得的产物在常温下浸泡2h，在微波功率为200W，处理IOmin ；(4)按质量比为1:20的比例，将步骤(3)获得的产物加水混合，在80°C浸提90min，抽滤，重复浸提2次，将滤液合并，浓缩至滤液体积的1/4 ；(5)向步骤(4)获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使浓度为25万u/L，50°C搅拌5h ；(6)将步骤(5)获得的产物与有机溶剂按体积比为5:1混合，震荡25min，4000r/min离心15min,去除蛋白质沉淀,得到上清液,重复加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；所述有机溶剂是体积比为5:1的氯仿和正丁醇混合液；(7)向步骤(6)获得的上清液中加入3倍体积的体积浓度为95%乙醇水溶液，4°C醇沉10h，4000r/min下离心15min，依次用乙醇、乙醚和丙酮反复洗涤沉淀2次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液；(8)将浓缩液过中性SephadexG-1O柱,调节螺动泵转速为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芦笋低聚糖的分离纯化方法，其特征包括下述步骤：（1）将速冻芦笋破碎，冷冻干燥，粉碎，过30～100目筛，得到芦笋干粉；（2）向芦笋干粉中加入相当芦笋干粉质量10～30倍的水，在?30～?18℃冻结6～12h，微波解冻；重复冻结解冻1～2次；（3）将步骤（2）获得的产物在常温下浸泡1～3h，在微波功率为100～300W，处理5～15min；（4）按质量比为1:5～40的比例，将步骤（3）获得的产物加水混合，在50～100℃浸提30～150min，抽滤，重复浸提1～4次，合并滤液，浓缩至滤液体积的1/5?1/3；（5）向步骤（4）获得的产物中，加入木瓜蛋白酶使浓度为20万～30万u/L，40～60℃搅拌4～6h；（6）将步骤（5）获得的产物与有机溶剂按体积比为4～6:1混合，震荡20～30min，3500～5000r/min离心10～20min，去除蛋白质沉淀，得到上清液，重复加有机溶剂，震荡，离心，至不出现白色蛋白质沉淀为止；所述有机溶剂是体积比为4～6:1的氯仿和正丁醇混合液；（7）向步骤（6）获得的上清液中加入2～4倍体积的体积浓度为95%的乙醇水溶液，4℃醇沉8～12h，将醇沉后的提取液在3500～5000r/min离心10～20min，依次用乙醇、乙醚和丙酮洗涤沉淀1?3次，冷冻干燥，得到芦笋粗多糖浓缩液；（8）将浓缩液过中性SephadexG?10柱，调节蠕动泵转速为2～3r/min，进样体积为0.4～1.0mL，收集体积为1～2mL，检测并合并单一高峰的低聚糖液，冷冻干燥得到芦笋低聚糖。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：寇晓虹，张莹，薛照辉，谢冰，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：