本发明专利技术提供一种siRNA-聚合物缀合物及其制备方法，更具体地，涉及一种通过siRNA和用于提高siRNA生物稳定性的聚合物的共价结合而形成的杂合缀合物，以及制备该杂合缀合物的方法。本发明专利技术的缀合物能提高siRNA的生物稳定性，从而实现治疗性siRNA向细胞的有效传递，且即使相对低浓度的小剂量也具有siRNA的活性。因此，该缀合物不仅可有利地用作癌症和其它传染性疾病的siRNA治疗工具，也可用作一种新型的siRNA传递系统。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种缀合物、制备该缀合物的方法以及利用该缀合物传递SiRNA的方法，其中，在癌症和其它传染性疾病的基因疗法中用于促进siRNA传递的聚合物通过可降解键(degradable bond)或不可降解键缀合到siRNA。
技术介绍
RNA干扰是指这样一种机制，其为在基因表达过程中，双链RNA(dsRNA)通过核苷酸序列特异性方式启动基因转录后沉 默，并且这种机制首先在线虫(C.elegans)中被发现，并常见于植物、果蝇和脊椎动物(Fire等，自然(Nature), 391:806-811, 1998 ；；Novina&Sharp,自然(Nature)，430:161-164，2004)。已知以如下方式发生RNA干扰:进入到细胞内的19 25bp的dsRNA与RISC(RNA_诱导的沉默复合物)结合，且仅反义(向导)链与mRNA结合而与mRNA的核苷酸序列互补，从而通过存在于RISC的核酸内切酶结构域降解革巴 mRNA(Rana, T.M.，Nat.Rev.Mol.Cell Biol., 8:23-36, 2007 ;Tomari, Y.和 Zamore, P.D., Genes Dev.,19:517-529，2005)。当dsRNA被传递到细胞中，它特异性地结合靶基因序列以降解mRNA，因此，它被认为是一种可调控基因表达的新型工具。然而，对于人类来说，由于向人体细胞引入dsRNA会诱导抗病毒干扰素途径，因此难以获得RNAi效果。在2001年，Elbashir和Tuschl等发现向人体细胞导入21nt长度(核苷酸长度)的小dsRNA不会引起干扰素途径，但特异性地降解靶mRNA (Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, ff., Yalcin, A., Weber, K., Tuschl, T.,自然(Nature), 411, 494-498, 2001 ； ；Elbashir, S.Μ., Lendeckel, ff., Tuschl, Τ.,基因(Genes)& Dev.,15,188-200, 2001 ； ；Elbashir, S.Μ., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel，ff.，Tuschl, T.，EMBO J.，20，6877-6888，2001)。因此，21nt 长度的 dsRNA 已经作为一种新型的功能基因组工具引起了公众的注意，并命名为小干扰RNA (siRNA)。自从siRNA被报道在动物细胞中抑制特定基因表达上具有极好的效果，siRNA作为一种基因治疗的药物引起了广泛关注。实际上，由于它的高活性和精确的基因选择性，根据20年的研究结果，siRNA有望成为一种目前用作治疗药物的反义寡核苷酸(ODN)的替代治疗药物(Dana J.Gary等，控释杂志(Journal of ControlledRelease) 121:64-73，2007)。用于治疗的siRNA技术具有显著的优势，与其它药物相比，它易于设计并具有高目标选择性和抑制特定基因表达的性能。此外，由于RNA干扰利用生命系统中天然存在的机制抑制基因表达，所以它毒性较低。目前0ΡΚ0 Inc.开发的湿性老年黄斑变性病的治疗药物“贝伐西尼(Bevasiranib) ”为一种siRNA，其可选择性地作用于血管内皮生长因子(VEGF)，诱导新血管形成以抑制VEGF的表达，并通过了三期临床试验(Dejneka NS 等，Mol Vis.，28 (14):997-1005，2008)。此外，目前正在研发含有祀向多种基因的siRNA的治疗药物(Ryan P.Million, Nature Reviews DrugDiscovery7:115-116，2008)。尽管各种结果表明体内通过RNA干扰诱导特异性的表达抑制，但siRNA在体内的传递还有许多问题需要解决，如在血液中被酶降解、与血液中组分的相互作用以及非特异性地传递给细胞(Shigeru Kawakami 和 Mitsuru Hashida, Drug Metab.Pharmacokinet.22(3): 142-151，2007)。正在通过部分地利用抗核酸酶的核苷酸类似物或改良传递技术，尝试克服这些问题。改良的传递技术的实例包括:利用病毒如腺病毒、逆转录病毒等的基因传递技术，以及利用脂质体、阳离子脂质和阳离子聚合物的非病毒载体的基因传递技术。然而，由于传递的基因有可能整合到宿主的染色体中，从而诱导宿主基因的正常功能发生异常并激活致癌基因，因此病毒载体存在安全性方面的问题，此外，即使以较小的量连续表达病毒基因也可能引起自身免疫性疾病，或在由病毒载体诱导的修饰的病毒感染情况下，可能不会引起有效的保护性免疫。同时，非病毒载体的有效性低于病毒载体，但考虑到体内安全性和经济可行性，其具有副作用低和生产成本低的优势(Lehrman S.，自然(Nature).401 (6753): 517-518，1999)。此外，非病毒传递方法要求有效地保护酶或非酶的降解，以便传递包括siRNA的RNA分子，其中一种方法为利用编码短发夹RNA (shRNA)的DNA表达质粒。通过DNA的系统的优势在于，仅当表达载体存在时进行siRNA表达。此外，目前siRNA化学修饰的研究提出一种用于改良针对核酸酶的稳定性以及低胞内摄取的方法(Shigery Kawakami和MitsuruHashida.Drug Metab.Parmacokinet.22(3):142-151，2007)。在一种siRNA的化学修饰中，作为被核酸酶降解部位的磷酸二酯键用硫代磷酸连接进行修饰，或戊糖的2’位被2’ -0-meRNA、2’ -脱氧-2’ -氟尿嘧啶核苷或通过2’位和4’位连接形成的锁核酸(LNA) 修饰,结果提高了血清中的稳定性((Braasch D.A.等,Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143，2003 ； ；Chiu Y.L.和 Rana Τ.Μ.，RNA, 9:1034-1048，2003 ；；Amarzguioui Μ.等，Nucleic Acid Res.31:589-595，2003)。在另一种化学修饰中，官能团连接到正义(反向导)链的3’端区域，结果与对照相比，药动力学特性得到了改良，体内通过siRNA的亲水性和疏水性的平衡在施用时诱导出较高的效率(Soutschek J.等，Nature432:173-1782004)。然而，上述方法在保护SiRNA免于核酸酶的消化以及改良细胞膜透性效率上仍然有许多有待改进之处。基于这一原因，专利技术人发现了一种缀合物，其中亲水性或疏水性聚合物通过可降解或不可降解键缀合到siRNA，改良了 siRNA的体内稳定性，并基于此完成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的在于提供一种缀合物，其中作为生物相容性聚合物的亲水性或疏水性聚合物通过可降解或不可降解键缀合到SiRNA的正义链或反义链的末端，以提高siRNA在细胞内传递的效率。本专利技术的另一个目的在于提供一种含有聚合物的固相支持物，具体地，施用到人体时稳定性得到证实的聚本文档来自技高网...
【技术保护点】
结合有聚乙二醇的固相支持物，其具有以下结构：其中R为烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂烷基或杂芳基；m为2～18的整数；n为5～120的整数；且X为氢、4?单甲氧基三苯甲基、4,4’?二甲氧基三苯甲基或4,4’,4”?三甲氧基三苯甲基。FDA00003102422000011.jpg
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩宝蓝，朴翰浯，申美湜，李三用，
申请(专利权)人：株式会社百奥尼，
类型：发明
国别省市：
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