本发明专利技术公开了一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基。所述工程菌是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA?pSVK-CAVA的大肠杆菌XL10-Gold，命名为E.coli?XL10-Gold/CAVA。每1L高产发酵培养基含：酪蛋白胨12g，酵母提取物16.61g，甘油3.05mL，NH4Cl?1g，0.17mol/L?KH2PO4和0.72mol/L?K2HPO4混合溶液100mL，MgSO4?0.185g，微量元素1mL。本发明专利技术的工程菌稳定性高、能连续传代30次以上，能满足质粒DNA疫苗pSVK-CAVA中试工艺的需要，利用高产培养基发酵后获得的质粒容积产率高，可用在黑色素瘤治疗性DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵生产中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
中质粒DNA疫苗的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基，特别是涉及一种黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的制备方法及其专用工程菌及高产发酵培养基。
技术介绍
质粒DNA疫苗是近年来经研究发现的一种极具发展潜力的新疫苗，从上世纪九十年代初期质粒DNA疫苗受到了科学家的关注，到现在发展近三十年，已经有了长足的发展。质粒DNA疫苗具有高安全性、无载体免疫原性和易于生产等特点，因此，同活病毒和病毒基础的疫苗相比，其具有独特的优势。数百项疫苗进入临床试验阶段，目前已有4种动物用质粒 DNA 疫苗及产品上市(Michele AK, David BW.DNA vaccines:ready for primetime Nature Reviews Genetics, 2008，9:776-788.)，人用质粒 DNA 疫苗及产品呼之欲出。因此，随着质粒DNA疫苗及产品的快速发展，建立符合药用标准的质粒DNA的大规模生产平台成为一个重大的研究课题。本专利技术针对质粒DNA疫苗的发酵工艺进行探索，是质粒DNA疫苗大规模生产发展中的基石，其重要性不言而喻。在质粒DNA疫苗大规模生产中，建立稳定的质粒DNA (或简称质粒)的种子库非常关键，由于质粒DNA (pSVK-CAVA)的分子量比较大，达到15kb左右，对于宿主菌是一种沉重的负担，在宿主菌的生长过程中，极易造成质粒DNA的不稳定性。质粒DNA的不稳定性，是指工程菌在生长过程中质粒DNA发生变化，结果不呈现原有的表型特征。质粒DNA的不稳定可分为两类:分离不稳定性和结构不稳定性(Filomena AQ, Fernanda OIPlasmid DNAfermentation stratagies:1nfluence on plasmid stability and cell physiology.Applied Microbial Biotechnology, 2012，93:2571-2580.)。分离不稳定是指在细胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部质粒DNA的丢失；结构不稳定则是由于质粒DNA上的缺失、插入或重排引起的，质粒DNA的分配不稳定性和结构不稳定性的结果都将使我们得不到预期的质粒DNA产量和质量。如果发生质粒DNA的分离不稳定，由于部分质粒DNA的丢失，工程菌的发酵过程实际上是工程菌和不含有质粒DNA的宿主菌的混合培养(ClarenceMO，Raelene P，Diane Wj et al.Cultivation of E.coli carrying a plasmid-basedMeasles vaccine construct(4.2kbp pcDNA3F)employing medium optimisation andpH-temperature induction techniques.Microbial Cell Factories,2011， 10:16.do1: 10.1186/1475-2859-10-16.)，在非选择性条件下，含有质粒DNA的工程菌的比生长速率(μ+)往往小于宿主细胞的比生长速率(μ _)，经过25代后，培养液中几乎都是无质粒DNA的细胞。由此可见，设计和筛选一种合适的工程菌来提高质粒DNA的生产率是非常重要的。培养基对质粒的稳定性和质粒质量也起着非常重要的作用，Silva (Silva, Filomena, Passarinha Lj et al.1nfluence of growth conditions onplasmid DNA production.Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，19(11) :1408-1414.)研究表明质粒在以葡萄糖作为碳源时的丢失频率大于以淀粉为碳源的培养基。FDA认为开环和线性化质粒DNA的治疗效果不如超螺旋质粒DNA(Food andDrug Administration(FDA), Guidance for industry: considerations for plasmiddeoxyribonucleic acid vaccines for infectious disease indications, 2007, http://www. fda. gov/cber/gdlns/plasdnavac. htm.),然而质粒DNA的几种形态在纯化的过程中很难分开，所以在发酵过程中应该在如何得到高比例的超螺旋质粒DNA方面进行优化(Ying C，Rodriguez S，Hebel H. DNA vaccine manufacture: scale and quality. ExpertReviews Vaccines, 2009, 8 (9) : 1277-1291.)。由此可见,设计和筛选一种合适的工程菌发酵培养基来提高质粒DNA的生产率是至关重要的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一个稳定性高、能多次传代的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌。本专利技术所提供的用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA (或称PSCK_2PFcGB)的大肠杆菌XLIO-Gold，命名为 E.coli XLIO-Gold/CAVA。将黑色素瘤治疗性pSVK-CAVA质粒DNA转化大肠杆菌XLlO-Gold得到转化菌XLlO-Gold,转化方法包括但不限于Hananhan法、Inoue法、氯化I丐法和电击转化法。将转化菌XLlO-Gold涂布于LB固体平板培养基，在37°C、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落；将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养，12小时转接传代I次，可连续传代30代；单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌。用氯化钙法转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌，转化方法为将-70 V保存的100 μ I感受态细胞XLlO-Gold于`冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA25-50ng,轻柔混匀后,置冰浴中30分钟；冰浴结束后，于42°C水浴中热击90秒，后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，加入800 μ I无抗性的LB液体培养基，混匀后于37 °C，200rpm振荡培养I小时，得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XLIO-Gold。本专利技术另一目的是提供一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的高产发酵培养基。该制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵培养基ITB，每IL培养基含酪蛋白胨 10_14g，酵母提取物 16-20g，甘油 2. 4-4mL, NH4Cl 0. 75_lg，0. 17moI/LKH2PO4和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO4 O. 168-0. 216g，微量元素 0. 75-lmL。较佳的，每IL培养基含酪蛋白胨12g，酵母提本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK?CAVA的工程菌，是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA?pSVK?CAVA（或称PSCK?2PFcGB）的大肠杆菌XL10?Gold，命名为E.coli?XL10?Gold/CAVA。
【技术特征摘要】
1.用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的工程菌，是转化有黑色素瘤治疗性质粒DNA pSVK-CAVA (或称PSCK_2PFcGB)的大肠杆菌XLIO-Gold，命名为E. coliXLIO-Gold/CAVA。2.根据权利要求I所述的工程菌，其特征在于是将黑色素瘤治疗性pSVK-CAVA质粒DNA转化大肠杆菌XLlO-Gold得到，包括但不限于使用Hananhan法、Inoue法、氯化I丐法和电击转化法得到转化菌XLlO-Gold ;再将转化菌XLlO-Gold涂布于LB固体平板培养基，在37°C、200rpm下培养15小时后挑取单克隆菌落；将单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，在37°C、200rpm下培养12小时后按照1:100进行连续传代培养，12小时转接传代I次，可连续传代30代；单克隆菌株以及传代30代以内历次传代菌株均为转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌。3.根据权利要求I所述的工程菌，其特征在于为用氯化钙法转化大肠杆菌XLlO-Gold的工程菌，转化方法包括将_70°C保存的100 ill感受态细胞XLlO-Gold于冰浴中解冻10分钟，然后加入pSVK-CAVA质粒DNA25-50ng，轻柔混匀后，置冰浴中30分钟；冰浴结束后，于42°C水浴中热击90秒，后迅速置于冰浴中冷却3-5分钟，加入800 U I无抗性的LB液体培养基，混匀后于37°C，200rpm振荡培养I小时，得到pSVK-CAVA质粒DNA的转化菌XLlO-Gold04.一种用于制备黑色素瘤治疗性质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的发酵培养基ITB，每IL培养基含酪蛋白胨 10_14g，酵母提取物 16-20g，甘油 2. 4-4mL, NH4Cl 0. 75_lg，0. 17mol/LKH2PO4 和 0. 72mol/L K2HPO4 混合溶液 75-100mL，MgSO4 0. 168-0. 216g，微量元素 0. 75-lmL。5.根据权利要求4所述的发酵培养基ITB，其特征在于，每IL培养基含酪蛋白胨12g，酵母提取物 16. 61g,甘油 3. 05mL, NH4Cl Ig, 0. 17mol/L KH2PO4 和 0. 72mol/LK2HP04 混合溶液 IOOmL, MgSO4 0. 185g，微量元素 ImL06.根据权利要求4`或5所述发酵培养基ITB，其特征在于，微量元素包括=FeCl3 6H2027g/L、ZnCl2 2g/L、CoCl2 6H20 2g/L、Na2MoO4 2H20 2g/L、C...
【专利技术属性】
技术研发人员：于继云，阎瑾琦，王宇，徐元基，张巍，吴昊，张亮，朱晓明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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