一种L-谷氨酸基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L-谷氨酸基因工程菌及其应用，所述基因工程菌是将谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达所得到的重组菌。本发明专利技术进一步对所述基因工程菌发酵生产L-谷氨酸的工艺进行优化，优化后的发酵工艺能够显著提高所述基因工程菌中L-谷氨酸的产量，达到大约150g/L的水平，并且发酵过程中糖酸转化率也有所提高，达到60%以上。本发明专利技术方法构建的基因工程菌稳定、质粒不易丢失，此外发酵方法简单易行、周期短、设备要求低，特别适合进行工业化大规模的生产。

L- glutamic acid gene engineering bacteria and application thereof

The invention discloses a L- glutamic acid gene engineering bacteria and its application, the gene engineering bacteria is the PEPC gene encoding phosphoenolpyruvate glutamic acid producing bacteria in pyruvate carboxylase and encoding glutamate dehydrogenase gene by GDH expression vector into glutamic acid producing bacteria in series by recombinant bacteria. The present invention further optimize the production process of L- glutamate the gene engineering bacteria fermentation, fermentation process optimization can significantly improve the gene engineering bacteria in L- glutamic acid production reached about 150g/L level, and the fermentation process of sugar acid conversion rate also increased, reaching more than 60%. The genetic engineering bacteria constructed by the method of the invention is stable and the plasmid is not easy to be lost. In addition, the fermentation method is simple and easy to operate, the cycle is short, and the equipment requirements are low, and the utility model is especially suitable for large-scale industrial production.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵及基因工程领域，具体涉及一种能够提高L-谷氨酸产量的基因工程菌、其构建方法及其在生产L-谷氨酸上的应用。
技术介绍
谷氨酸(Glutamic acid),其学名为2_氨基_5_羧基戍酸,是构成蛋白质的20种常见氨基酸之一，在生物体内的蛋白质代谢过程中占有重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。L-谷氨酸是谷氨酸的左旋体，其具有增鲜、降低血氨、改善中枢神经系统、改善儿童智力发育、扩张血管、增强血液循环、促进花穗发育等功能，并且可以生产许多重要的下游产品，如L-谷氨酸钠、L-苏氨酸、聚谷氨酸等，被广泛应用于食品、医药、人造制革、化妆品、农业等行业。谷氨酸的制备起始于18世纪。1866年德国化学家从小麦面筋的水解物中提取得到谷氨酸，1957年日本率先采用微生物发酵的方法生产谷氨酸，因发酵法具有原料成本低、反应条件温和、可大规模生产等优点，目前仍是谷氨酸生产的主要方法。目前我国发酵生产谷氨酸的菌种主要包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、天津短杆菌(Brevibacterium tianjinese)、纯齿棒杆菌(Corynebaclerium crenalum)、北京棒杆菌(Corynebaclerium pekinense)、黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)以及它们的突变株,如天津短杆菌T613的 突变株TG-916、FM-415、CMTC6286、S9114等，钝齿棒杆菌ASL 542的突变株B9、F-263，北京棒杆菌ASl.299的突变株7338、D110、WTH-1等。上述谷氨酸生产菌主要是通过选育及诱变育种的方式获得，其产酸能力伴随着谷氨酸发酵生产的发展获得了很大的提高。然而在现有的产酸能力下，继续采用经典微生物育种的方式来选育菌种，以期达到大幅度提高产酸率和糖酸转化率已经相当困难。近年来，随着谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032基因组测序的完成以及谷氨酸棒杆菌基因操作技术的不断完善，使得通过分子生物学手段对谷氨酸棒杆菌进行相关改造成为现实。谷氨酸的生物合成的途径包括糖酵解作用(EMP途径)、磷酸戊糖途径(HMP途径)、三羧酸循环(TCA循环)、乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路等。在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要反应包括谷氨酸脱氢酶(GHD)所催化的还原氨基化反应、转氨酶(AT)所催化的转氨反应以及谷氨酸合成酶(GS)所催化的合成反应，其中还原氨基化反应为主导反应。由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想代谢途径是先通过EMP和HMP途径生成丙酮酸，丙酮酸一部分在丙酮酸脱氢酶系统作用下生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶的催化下合成柠檬酸，进入TCA循环，最终生成α -酮戊二酸，其经谷氨酸脱氢酶作用经还原氨基化作用生成谷氨酸，此时理论糖酸转化率为81.7%。日本味之素株式会社依据谷氨酸合成的代谢途径对谷氨酸生产菌种作了一些基因改造，如在公开号为CN1261627A的中国专利技术专利中公开了通过在培养基中培养属于肠细菌并具有L-谷氨酸生成能力的引入了来自棒状细菌的柠檬酸合成酶基因微生物来生产L-谷氨酸；在CN1270226A中公开通过增加编码细胞内丙酮酸脱氢酶的基因的拷贝数获得的增强的细胞内丙酮酸脱氢酶活性和具有谷氨酸生产能力的棒杆菌细菌；在CN1938418A中公开通过在培养基中培养其中L-谷氨酸输出基因YHFK基因的表达增强或过表达的微生物以产生并导致L-谷氨酸在培养基中累积等。除了上述酶外，在谷氨酸生物合成代谢途径中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定化从而使磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的关键酶，如CO2固定反应不起作用，则丙酮酸将全部氧化成乙酰CoA，再通过乙醛酸循环供给四碳二羧酸，此时理论糖酸转化率仅为54.4%，因此通过该酶的过量表达可能提高谷氨酸的发酵水平。此外，谷氨酸脱氢酶是谷氨酸合成途径中另一个关键酶，该酶催化α -酮戊二酸还原生成L-谷氨酸且受L-谷氨酸的反馈作用，因此过表达该酶可解除L-谷氨酸的反馈作用，从而达到提高产量的目的。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种依据代谢工程理论来通过分子生物学方法构建的谷氨酸基因工程菌，对该基因工程菌进行发酵可以显著提高L-谷氨酸的产量以及糖酸转化率。为了达到上述目的，本专利技术一方面提供一种高产L-谷氨酸的基因工程菌，其是将谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的Pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达所得到的重组菌。特别是，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶用于催化CO2固定化从而使磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸，谷氨酸脱氢酶用于催化α -酮戊二酸还原生成L-谷氨酸，这两种酶的大量表达有利用谷氨酸生产菌利用葡萄糖大量积累L-谷氨酸，从而提高谷氨酸的产量及糖酸转化率。理论上，所有的谷氨 酸生物素营养缺陷型菌株均适用于本专利技术，目前现有技术中以糖质为碳源的谷氨酸产生菌几乎都是生物素营养缺陷型。特别是，本专利技术所述谷氨酸生产菌选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、天津短杆菌(Corynebacteriumtianjin)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、纯齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、黄色短杆菌(Brevibacterium f Iavum)中的一种，优选为谷氨酸棒杆菌⑶K-9、北京棒杆菌ASl.299、钝齿棒杆菌ASl.542、天津短杆菌T613中的一种，进一步优选为谷氨酸棒杆菌GDK-9 (其具有酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰抗性遗传标记，其定向育种研究已于2008年在《食品与发酵工业》第34卷第7期发表，现保藏于天津科技大学代谢工程研究室)；所述表达载体为PXMJ19。特别是，所述基因工程菌的构建方法包括:利用PCR技术扩增谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的Pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶编码的gdh基因，将所述pepc基因和gdh基因克隆至表达载体后，转入谷氨酸生产菌中进行串联表达，得到所述基因工程菌。尤其是，所述基因工程菌为⑶K-PG，其构建方法包括:I)利用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)的 pepc 基因的DNA序列(GeneID:3343481)和gdh基因的DNA序列(GeneID: 3343980)分别设计引物；2)以谷氨酸棒杆菌⑶K-9的基因组DNA为模板进行PCR扩增；3)回收PCR扩增产物，与穿梭质粒pXMJ19进行连接，得到重组的表达载体PXMJ19PG ；4)将重组的表达载体pXMJ19PG导入谷氨酸棒杆菌⑶K_9的感受态细胞，筛选阳性转化子，即构建得到谷氨酸基因工程菌GDK-PG。其中，所述谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态细胞采用常规方法制备得到。本专利技术另一方面提供所述的基因工程菌在生产L-谷氨酸上的应用。特别是，所述应用是利用所述基因工程菌发酵生产L-谷氨酸。本专利技术再一方面提供一种生产L-谷氨酸的方法，将所述基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L?谷氨酸基因工程菌，其特征在于，其是将谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的pepc基因以及编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达所得到的重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种L-谷氨酸基因工程菌，其特征在于，其是将谷氨酸生产菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的P印c基因以及编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因通过表达载体引入谷氨酸生产菌中进行串联表达所得到的重组菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸生产菌选自谷氨酸棒杆菌、天津短杆菌、北京棒杆菌、钝齿棒杆菌中的一种，所述表达载体为PXMJ19。3.权利要求1或2所述的基因工程菌在生产L-谷氨酸上的应用。4.一种生产L-谷氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，制得L-谷氨酸。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为:葡萄糖70-90g/L，玉米浆 3-6ml/L,豆饼水解液 15_25ml/L，KC10.5_2g/L，Na2HPO4.12H200.5_2g/L，MgSO4.7H201-2g/L, MnSO4.H201_3mg/L，FeSO4.7H201_3mg/L，VB10.1-0.5mg/L,发...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱博，谢希贤，张成林，万红兵，欧阳宇红，曹文杰，
申请(专利权)人：北京轻发生物技术中心，天津科技大学，
类型：发明
国别省市：