本发明专利技术涉及一种β-琼胶酶及重组表达菌株，所提供的β-琼胶酶的重组菌株能够高效的表达氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1的β-琼胶酶，表达出的β-琼胶酶具有耐高温的特性。本发明专利技术的重组菌株能搞高效的表达β-琼胶酶，表达的β-琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因筛选应用
，具体涉及一种β -琼胶酶及重组表达菌株，即一种来源于嗜琼胶卵链菌(Catenivulum agarivorans gen.nov.sp.ηον.)ΥΜ01 的β -琼胶酶基因ΥΜ01-3及用于重组表达该酶的重组菌株。
技术介绍
在自然环境中，琼胶酶的分布较广，很多微生物和一些海洋软体动物都能产生琼胶酶。现阶段，绝大多数被分离研究的琼胶酶都是来自微生物，而海洋细菌又是产琼胶酶最多的类群。琼胶降解菌在海洋生态系统中分布广泛，在海洋植物、动物、海水及海洋沉积物中均有分布。根据氨基酸序列的相似性，琼胶酶被归属为糖苷水解酶家族(Glycosidehydrolase family)中的GH- 16,GH- 50和GH- 86。根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式不同，可以把琼胶酶分为两类:α -琼胶酶和β -琼胶酶。α -琼胶酶裂解琼脂糖的α _1，3糖苷键，生成以D-半乳糖为非还原性末端和以3，6-内醚-a - L-半乳糖为还原性末端的的琼寡糖系列；β -琼胶酶裂解琼脂糖的1，4糖苷键，生成以β- D-半乳糖为还原性末端和以3，6-内醚-a - L-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖系列。已有证据表明，这些琼胶寡糖尤其是新琼寡糖具有很多的生理和生物活性。例如新琼寡糖对黑色素瘤细胞具有保湿和美白效果，还具有抑制微生物生长，刺激巨噬细胞活性的作用；琼胶寡糖在体内体外都具有清除ROS (Reactive Oxygen Species,活性氧簇)造成的氧化损伤的作用，因此可以应用在化妆品和保健品领域。综上所述，可以看出琼寡糖在功能食品、药物、化妆品等领域都有非常广泛的应用前景。目前常用的琼寡糖生产方法主要有化学法和酶解法两种。传统的化学制备方法反应条件比较剧烈，专一性差，很难得到单一大小的寡糖，而且水解产物容易破坏，不利于产物的分析和回收，这些都限制了琼寡糖的使用。而琼胶酶酶解法由于高度专一高效，反应条件温和，易于控制，产物不易被 破坏，因此有利于特定寡糖的大量制备和回收，必将成为琼寡糖生产的主要方法。虽然琼胶酶制备寡糖具有很多优势，但目前在工业上并没有得到广泛应用。这主要是因为目前发现和研究较多的是中温琼胶酶。由于提取纯化的费用高、酶产量低，贮藏和处理过程中酶活容易损失，贮存期短、运输费用高等缺点，导致这些酶的应用受到限制；而耐高温琼胶酶由于具有良好的高温稳定性，寿命一般长于中温酶，而且制备和使用过程中不需要冷却设备，可以显著降低成本，因此，在工业上具有更广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种β -琼胶酶及重组表达菌株，所提供的β -琼胶酶的重组菌株能够高效的表达，表达出的β_琼胶酶具有耐高温的特性，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的一个方面提供一种β -琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。用于编码本专利技术β_琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID Ν0:2。本专利技术的另一个方面提供一种用于表达上述β -琼胶酶的重组表达载体。本专利技术的β -琼胶酶用于降解琼胶制备新琼寡糖。本专利技术另一方面提供用于重组表达上述β_琼胶酶的重组菌株，为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3)/Pet24a( + )/YM01-3，已于 2013 年 3 月 I 日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7268。本专利技术的重组菌株能搞高效的表达β -琼胶酶，表达的β -琼胶酶具有耐高温的特性，能够特异性地降解琼胶产生聚合度为4-10的新琼寡糖，终产物为新琼四糖和新琼六糖，具有很好的工业应用前景。附图说明图1:本专利技术的β_琼胶酶的耐高温效果检测(显示降解圈)，其中左边样品未煮过，右边样品沸水煮过5min ；图2:本专利技术的β -琼胶酶的应用效果。具体实施例方式下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。实施例1: β -琼胶酶基因ΥΜ01-3的分离通过对嗜琼 胶卵链菌YMOl进行全基因组测序得到15个琼胶酶基因及其基因序列，包括13个β -琼胶酶基因和2个α -琼胶酶基因，ΥΜ01-3是其中的一个β -琼胶酶基因。利用生物学软件 Primer5.0 设计上游引物(5' - CCGGAATTCATGTATGCAGCAGACTGGGAT-3')和下游引物(5' - CCGCTCGAGTTGGAACTTCCATTGCTGG-3')以基因组 DNA 为模板，进行PCR反应，PCR反应组成如下(25 μ I反应体系):ddH20 10.5 μ 1、上游和下游引物各0.5 μ 1，DNA模板 1μ 1,2XMasterMix 12.5 μ I。反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性 lmin，60°C退火lmin，72°C延伸1.5min，72°C终延伸lOmin，共30个循环。反应结束后，将PCR产物回收得到琼胶酶基因YM01-3，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2，其翻译的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。多个测序结果也获得了相同的结果。实施例2:大肠杆菌克隆载体I3UCm-T — YMO1-3的构建将β -琼胶酶基因ΥΜ01-3与载体PUCm-T的连接，采用DNA Ligation Kit连接，连接体系(10 μ I)如下:Solution I 5 μ 1，DNA 片段 4 μ l，PUCm_T 载体 I μ I。16°C连接 16h所得到的连接液即可获得大肠杆菌克隆载体PUCm-T — YMO1-3，用于转化大肠杆菌JM109。实施例3:大肠杆菌重组株JM109—PUCm-T — YMO1-3的构建加入200 μ I解冻的感受态Ε.coli JM109和10 μ I实施例2得到的连接液至2mlEppendorf管中，冰浴30min，42°C 90s，冰浴2min，加入LB培养基800 μ 1，37°C振荡培养I小时。菌液与4μ I IPTG及40μ1 X-gal混合后涂布于含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12-14h。挑取白色菌落做PCR及双酶切检测，酶切体系(20 μ I)如下:ddH208μ l，PUCm-T—YM01-3 质粒 DNA 8 μ 1，EcoR I I μ 1，Xhol I I μ 1,10ΧΗ Buffer 2μ1，琼脂糖凝胶电泳中出现1260bp特异带者为阳性转化克隆，即含有I3UCm-T — YMO1-3的大肠杆菌JM109—PUCm-T—YM01-3。将Iml阳性克隆菌液送测，以M13测序通用引物测定外源插入序列YMO1-3核苷酸序列。实施例4:大肠杆菌表达载体pET24a(+) — YM01_3的构建克隆载体PUCm-T — YM01-3和表达载体pET24a(+)分别用EcoR I和Xhol I双酶切，酶切体系(20 μ I)如下:反应体系1:ddH20 8 μ 1，PUCm-T-YMO1-3 质粒 DNA 8 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组菌株，所述的菌株用于重组表达氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1的β?琼胶酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：史晓翀，张晓华，董素洁，崔方元，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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