一种内切型β-琼胶酶及其制备方法，涉及琼胶酶。提取Flammeovirga sp.SJP92基因组DNA，通过PCR扩增获得了琼胶酶rAgaA的核苷酸序列，并鉴定了该核苷酸序列agaA。通过穿梭质粒pHT43构建了重组质粒pHT43-AgaA，在枯草芽孢杆菌WB800N中进行重组蛋白的表达。纯化后的蛋白纯度高，活力好，为其实际应用提供了基础。通过同源重组表达β-琼胶酶，可以克服分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、农业等领域奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及琼胶酶，尤其是涉及一种内切型0 -琼胶酶及其制备方法。
技术介绍
琼胶是一种为人所熟知的海洋性多糖，由含量较高、分子量较大、硫酸基较少的 琼脂糖以及含量较少、分子量较小、硫酸基和其它取代基团较多、成分较复杂的琼脂胶组 成。无论是琼脂糖或者琼脂胶，它们的多糖链都是由（1 _3)-0_D-半乳糖和（1_4)-3、6_内 醚-a-L-半乳糖通过a-1，3和0 -1，4糖苷键相互交替连接而成。只是琼脂胶多糖链上 的（1-4)-3、6_内醚-a-L-半乳糖的羟基被硫酸基、甲氧基、丙酮酸等基团取代。 琼胶酶是一类能够水解琼脂糖的糖苷酶。根据水解方式的不同，可以分为a-琼 胶酶和0 _琼胶酶。a-琼胶酶可以破坏琼脂糖的a-1，3糖苷键生成以3、6-内醚-a-L-半 乳糖为还原末端的琼胶寡糖系列，而0琼胶酶可以降解琼脂糖的0_1，4糖苷键，生成以 0 -D-半乳糖为还原末端的新琼胶寡糖系列。 琼胶酶在科学研究、食品与医疗保健等领域具有广泛的应用。它可用于DNA回收、 藻类原生质体的制备、藻类单细胞的制备等领域。随着海藻寡糖研究的兴起与深入，越来越 多的研究证明，琼胶寡糖具有多种生理功能，例如抗癌、抗炎、抗氧化、美白、增加肠道益生 菌等。与传统的酸碱制备法相比，琼胶酶酶解法高效、温和、低耗、产物稳定，是制备琼胶寡 糖的首选方法。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种内切型琼胶酶基因的核苷酸序列； 本专利技术的第二个目的是提供一种内切型0 _琼胶酶蛋白质的氨基酸序列； 本专利技术的第三个目的是提供一种内切型0 _琼胶酶的制备方法； 本专利技术的第四个目的是提供一种内切型琼胶酶的酶学特征。Flammeovirgasp.SJP92 0 -琼胶酶已于2014年11月27日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏中心登记入册编号：CGMCCNo. 10071。 本专利技术所述内切型e -琼胶酶基因，其编码的核苷酸序列记为agaA。 所述内切型P_琼胶酶基因，其特征在于所述P_琼胶酶基因agaA的分子类型为 DNA，序列特征：长度为1515bp，类型为核苷酸，链性为双链，拓扑结构为线性，所述内切型 琼胶酶基因的序列如下所示，记为SEQIDNo. 1 : 1501CTTCTAATCAATTAA 本专利技术所述内切型琼胶酶基因，其核苷酸序列采用以下方法获得：提取 Flammeovirgasp.SJP92 的总DNA，以合成序列SEQIDNo.3、SEQID吣.4作为引物，经卩0? 扩增获得agaA基因核苷酸序列SEQIDNo. 1。agaA基因相关的核苷酸序列SEQIDNo. 1 通过基因预测获得基因编码的多肽SEQIDNo. 2序列。然后通过枯草芽孢杆菌WB800N表 达agaA基因，纯化agaA基因的表达产物，并通过生物学方法证明agaA基因编码的多肽SEQ IDNo. 2 (不含信号肽）具有琼胶酶活性； 本专利技术所述内切型P_琼胶酶包括具有降解琼脂糖活性的P_琼胶酶rAgaA。所述合成序列SEQIDNo. 3：GCTCTACAATGCAAGAATGGAGCAACA； 所述合成序列SEQIDNo. 4 : TCCCCCGGGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATTGATTAGAAGTTTTTGAGCT； 所述内切型琼胶酶，其分子类型为蛋白质，序列特征：长度为504aa，类型为氨 基酸，所述内切型琼胶酶的氨基酸序列如下所示，记为SEQIDNo. 2: 1 MKNNYLLILFFFFLGNEINAQEWSNIPVPAYAGPGNTWELQGNLSDDFNYNFNAVNYKT'N 61 FGNGKWYNFYHNAWDGPGTTYWKHNRVKVDGDNLVITYAKTNNTTKMGIPGVLSGCVTSN 121 NRVTYPVYVESAISVANISLASCFWLLSPDDTQEIDIIENYGNVPWFKQFTHISHHSFIR 181 SPFTDYQPKDWNSWYQDSRVNGNYGWGDWCWNNGNRRYMRMGVYWVGPEHFEYYIDGQLV 241 RVMYNNATATKVDGTWQYQyFNSMSGQFPTNNSSGYTAVTTYATSSNYNFSTLQAASMS 301 NGISVVDPGNFQGGRGFTKAMDI1LNYESQQWLALNHTPSDSDLASSARNQMKVDWVRVY 361 KPKSSSGSGSSNGTTCADAPSYNGNSNSYSAGQYVINGGILYRKRSDGQffDYIANCGSNS 4:21 RISDAVVENLAYERISLSPNPAKNFVRISGLAEGDFEAVIVSLQGNVJSSQIVNKEANTL 481 STTHLSPGVYIIKVAGEAQKLLIN 本专利技术所述内切型P-琼胶酶rAgaA的制备方法，包括以下步骤： 1)Flammeovirgasp.SJP92 基因组DNA提取； 2)内切型0 -琼胶酶基因agaA的PCR扩增与序列分析； 3)内切型-琼胶酶重组质粒pHT43_AgaA的构建； 4)内切型琼胶酶重组质粒pHT43-AgaA转化枯草芽孢杆菌WB800N; 5)内切型-琼胶酶rAgaA的表达与纯化。 本专利技术从Flammeovirgasp.SJP92的基因组DNA中克隆了内切型-琼胶酶基因 agaA，通过构建重组表达载体，在枯草芽孢杆菌WB800N中进行重组蛋白表达，克服了原菌 分离纯化过程中复杂繁琐的不足。同时纯化后的酶纯度高、活力好，为该酶能广泛应用于生 物、食品、医药等研究领域奠定基础。【附图说明】 图1为内切型0 -琼胶酶rAgaA的SDS-PAGE与酶活染色图。在图1中，M:蛋白 Marker;1:rAgaA的SDS-PAGE;2:rAgaA的酶活染色。 图2为pH值对内切型琼胶酶rAgaA活力的影响。在图2中，横坐标为pH值， 纵坐标为相对活力。 图3为温度对内切型0 -琼胶酶rAgaA活力的影响。在图3中，横坐标为温度 (°C)，纵坐标为相对活力。 图4为内切型e-琼胶酶rAgaA的温度稳定性。在图4中，横坐标为温度（°C)， 纵坐标为相对活力。 图5为薄层层析法分析内切型0 -琼胶酶rAgaA的酶解产物。在图5中，DP4:琼 胶四糖；DP6 :琼胶六糖；DP8 :琼胶八糖。 图6为核磁共振法分析内切型0 -琼胶酶rAgaA的酶解产物。在图6中，A为3、 6-内醚-a-L-半乳糖；B为0 -D-半乳糖；r为还原端；nr为非还原端；a为a异头碳； 0为0异头碳。【具体实施方式】 下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如分子克隆实验室手册（1、萨姆布鲁克，拉塞尔（著），黄培堂（译），《分子克隆实验指 南》，科学出版社，2002年，第三版）中所述实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议的 条件。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施，其具体步骤是： 1.Flammeovirgasp.SJP92基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
内切型β‑琼胶酶基因，其特征在于编码一种内切型β‑琼胶酶的核苷酸序列，记为agaA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：阮灵伟，黄能平，施泓，徐洵，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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