一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是通过病菌分离、病菌培养、诱导产孢、制备孢子悬浮液步骤获得的。所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液应用于烟草品种抗感赤星病测定中，或防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中，或研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中。本发明专利技术采用多点接种方式，培养速度快、培养周期短；利用低温高湿刺激、梯度降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，为常规产孢量的50~100倍。本发明专利技术方法污染小，培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，同步生长、同步产孢，同批次、不同批次制备孢子量差异小，质量更为稳定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业微生物
，具体涉及一种烟草赤星病菌孢子悬浮液及其应用。
技术介绍
烟草赤星病(Tobacco Brown Spot)是烟叶成熟期普遍发生的叶部病害，其病原为链格孢菌(Altorimriei alternata)。目前,在实验室一般采用平板培养菌丝、自然产孢后制备烟草赤星病菌孢子悬浮液，但其菌丝培养时间通常在10天以上才能长满平板，菌丝老熟、产孢量足以制备孢子悬浮液还需要继续培养5 10天，由于其培养时间长，容易造成培养基干燥，培养物污染，而且不经过诱导菌丝产孢效率低。尽管有个别研究通过紫外光诱导可加快产孢，但紫外剂量与时间难以控制，容易造成变异，也容易导致培养物污染。因此，如何更为有效的制备烟草赤星病菌孢子悬浮液是一个亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种培养快速、产孢量大、质量稳定的烟草赤星病菌孢子悬浮液，第二目的在于提供该烟草赤星病菌孢子悬浮液的应用。除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为质量百分数。本专利技术的第一目的是这样实现的，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的: A、病菌分离:从发病 田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种； B、病菌培养:将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3 4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27 29°C恒温培养4飞(1，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢； C、诱导产孢:将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2 4°C的冰箱内黑暗诱导培养2 3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2 3d由20°C降温至15°C ； D、制备孢子悬浮液:诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎f2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。本专利技术的第二目的是这样实现的，所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用；或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用；或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用。本专利技术采用多点接种方式，能够较快长满平板，比常规中央平板接种方式要缩短3 4天；通常病菌在培养基平板上由于营养耗尽、菌丝老熟而激发和促进自然产孢，产孢时间比较分散，比本专利技术产孢时间还要延长2 3天以上。本专利技术缩短培养时间达5 7天，培养周期大大缩短。本专利技术利用低温高湿刺激、梯度程序降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，病菌在前期适温、短时间光照(相当于短日照)培养时，菌丝生长速度快；在2 4°C黑暗冰箱中造成低温高湿刺激，20°C到15°C梯度程序降温、黑暗诱导直接促进了老熟菌丝大量产生孢子；经测算，同样大小的培养基平板，利用本专利技术方法产孢量为常规产孢量的5(Γ100倍。本专利技术由于接种量大、病菌前期培养菌丝生长快，诱导产孢时为密封状态，大大降低了培养物被污染的机会，从而保证了培养质量；培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，能够达到同步生长、同步产孢，同一病菌同批次、不同批次间制备的孢子量差异小，所以质量更为稳定。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变更或改进，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的: Α、病菌分离:从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种； B、病菌培养:将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3 4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27 29°C恒温培养4飞(1，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢； C、诱导产孢:将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2 4°C的冰箱内黑暗诱导培养2 3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2 3d由20°C降温至15°C (降温速率约每9.6 14.4h降温1°C); D、制备孢子悬浮液:诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎f2min，使孢子与菌丝分`离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。作为优选实施方式: B步骤所述的培养基为燕麦培养基(0A)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、马铃薯蔗糖培养基(PSA)、查彼培养基(Czapek’ s medium)或理查培养基(Richard’ s medium)。D步骤所述的促进孢子萌发的溶液为f 2%的灭菌葡萄糖、果糖、蔗糖、蛋白胨溶液中一种或一种以上组合。或者，D步骤所述的促进孢子萌发溶液为2 5%感病品种烟草成熟的新鲜烟叶组织捣碎液，所述的组织捣碎液是经过滤灭菌的。所述的感病品种烟草为K326、云烟85或G140。D步骤所述的组织捣碎采用的是研钵、捣碎机或研磨机。D步骤所述的过滤为脱脂棉过滤或4飞层脱脂纱布过滤。本专利技术所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在烟草品种抗感赤星病测定中的应用，是将烟草赤星病菌孢子悬浮液调整浓度、加入分散剂作为烟草赤星病的人工接种物。或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在防治烟草赤星病药剂、生防菌或天然产物筛选中的应用，调整烟草赤星病菌孢子悬浮液浓度涂布平板即可。或所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液在研究烟草赤星病菌的土壤生态及病菌侵染循环中的应用，调整烟草赤星病菌孢子悬浮液浓度后，吸附于载体上，然后埋入或拌入土壤。本专利技术的工作原理: 本专利技术采用多点接种方式，加快了培养进程，缩短培养周期。本专利技术利用低温高湿刺激、梯度程序降温、黑暗诱导等方法的综合作用促进烟草赤星病菌快速、大量的产生孢子，产孢量为常规产孢量的5(Γ100倍。本专利技术由于接种量大、病菌前期培养菌丝生长快，诱导产孢时为密封状态，大大降低了培养物被污染的机会，从而保证了培养质量；培养菌丝、诱导产孢的时间相对固定、集中，能够达到同步生长、同步产孢，同一病菌同批次、不同批次间制备的孢子量差异小，所以质量更为稳定。实施例1 从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27°C恒温培养4d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；将符合诱导产孢条件的培养基平板，在密封状态下置于2°C的冰箱内黑暗诱导培养2d，然转入培养箱黑暗、梯度降温培养，历时2d由20°C降温至15°C (降温速率约每9.6h降温1°C);诱导培养完成后，以1%的灭菌葡萄糖溶液作为促进孢子萌发溶液，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，以研钵组织捣碎lmin，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后用脱脂棉过滤过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。实施例2 从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于29°C恒温培养6d本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草赤星病菌孢子悬浮液，其特征在于所述的烟草赤星病菌孢子悬浮液是按以下步骤制备的：A、病菌分离：从发病田块中采集有典型症状的烟草病叶，经过分离、纯化、致病力测定筛选出烟草赤星病菌菌种；B、病菌培养：将菌种产生孢子的菌丝点接到培养基平板上，每个平板接种3~4点，在18h黑暗6h光照交替条件下，于27~29℃恒温培养4~6d，选择菌丝呈黑褐色、菌丝较致密的培养物用于诱导产孢；C、诱导产孢：将符合诱导产孢条件的培养基平板密封后置于2~4℃的冰箱内黑暗诱导培养2~3d，然后转入培养箱，黑暗、梯度降温培养，历时2~3d由20℃降温至15℃；D、制备孢子悬浮液：诱导培养完成后，使用促进孢子萌发溶液将培养基平板上的孢子和菌丝洗下，组织捣碎1~2min，使孢子与菌丝分离、孢子从孢子链断开成单孢，然后过滤除去菌丝，滤液即为赤星病菌孢子悬浮液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：方敦煌，刘勇，李永平，肖炳光，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：