一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用。本发明专利技术所提供的金龟子绿僵菌菌株命名为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9780。该菌株生长速度快、产孢能力强，同时对油茶象幼虫的致病力高，以107孢子/mL的孢子悬浮液接种后对油茶象幼虫的LT50（致死中时）为1.65天。利用该菌株生产的真菌制剂，对油茶象的防治效果好，能有效控制油茶象种群密度，是一株在油茶象的防治上具有潜在价值的生防菌株，对促进油茶优质丰产具有积极意义。

【技术实现步骤摘要】
一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用
本专利技术属于生物防治领域，涉及一株绿僵菌菌株及其应用，具体地说是涉及一株对油茶象幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌及其应用。
技术介绍
油茶（Oil-teaCamellia）是我国特有的木本食用油料树种，主要分布在长江流域及其以南的14个省(市、区)。油茶象CurculiochinensisChevrolat又名茶籽象甲、油茶中华实象，隶属于象虫科象甲属，是危害油茶果实最为严重的一种害虫，也是全国林业危险性有害生物（国家林业局，2013）。该虫幼虫在果内蛀食果仁，使茶籽严重减产，并且影响茶油品质。据调查，油茶象危害后落果率可达到69.2%。油茶作为食用油料树种，探寻害虫生物防治，尽量少用或避免使用化学农药已成为生产上的迫切需要。绿僵菌属虫生真菌，目前已知能寄生8个目42个科的200多种昆虫，以及螨类和线虫等。绿僵菌具有适应性强、在土壤中和林间能长期宿存、致病周期短、对人畜无毒害以及对环境友好等特点。金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）是应用最为广泛的绿僵菌种类，据不完全统计，近年来世界各地用金龟子绿僵菌对近百种森林、农作物及卫生害虫进行了防治试验；特别是作为一种防治地下害虫较为有效的真菌杀虫剂，其在防治中已有应用实践，取得了良好的效果。油茶象虽然是蛀果害虫，但其老熟幼虫出果后在土壤中滞育时间长达一年以上直至化蛹羽化为成虫出土。据检索，目前利用虫生真菌防治油茶象幼虫的研究尚未见报道，为此，筛选出对其幼虫致病力强的金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）菌株，为生产上提供优良菌株和菌剂具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株对油茶象幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用。一株金龟子绿僵菌，命名为金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa201101菌株，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCCNo.9780。该金龟子绿僵菌菌株（Metarhiziumanisopliae）FJMa201101具有以下特征：在PPDA培养基上25±1℃下生长5天，菌落直径18mm，15天达58mm。菌落初期为白色，质地绒毛状或棉絮状，逐渐扩大；其上产生暗绿色分生孢子并成环状分布，粉末状。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.3μm~3.2μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为4.5~6.8μm×1.8-2.9μm。最佳生长温度范围为23~28℃。本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供用于防治油茶象幼虫的菌株和菌剂。本专利技术所提供的菌剂具体可分为分生孢子悬浮液或孢子粉剂。其中孢子悬浮液的浓度为107孢子/ml。分生孢子粉剂含量为60~80亿孢子/克菌剂。本专利技术所提供菌剂的有效成分是上述金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa201101的分生孢子。本专利技术所提供的或所述菌剂可用于防治油茶象幼虫。本专利技术提供的金龟子绿僵菌菌株（Metarhiziumanisopliae）FJMa201101具有如下有益效果：生产性状好，产孢能力强，同时对油茶象幼虫的致病力强，采用浓度为107孢子/ml的孢子悬浮液浸渍法接种其LT50为1.65d，感染率为86.6%；采用孢子拌土法（接种量为105孢子/g土）LT50为2.11d，感染率为94.5%。利用该菌株生产的菌剂，能显著降低油茶象幼虫林间种群数量。同时该菌株能在土壤中长期宿存，具有较强的二次侵染能力，适合在亚热带地区的油茶象发生林分中应用。本专利技术的优点在于：为油茶象幼虫防治提供了高致病力菌株和菌剂；同时绿僵菌具有在土壤中和林间能长期宿存、对人畜无毒害以及对环境友好等特点，本专利技术的高效金龟子绿僵菌菌株和菌剂可解决以往油茶象采用化学防治带来的环境污染、农药残留等问题。本专利技术具有良好的应用前景。附图说明图1为金龟子绿僵菌FJMa201101菌株在PPDA培养基上25±1℃下培养15天的菌落形态图。图2为油茶象幼虫被金龟子绿僵菌FJMa201101感染症状。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中的PPDA培养基是指蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基的英文缩写，其具体配方为每1000ml水中含有马铃薯200g（切块煮熟后过滤，取滤液），葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g。实施例1金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa201101的鉴定形态学鉴定将分离纯化的金龟子绿僵菌菌株在直径为90mm的平板PPDA培养基上于25±1℃条件下培养，4-5天后挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10-12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征。该菌株菌落质地棉絮状，菌落初期为白色，逐渐扩大，其上产生暗绿色分生孢子并成环状分布。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.3μm~3.2μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为4.5~6.8μm×1.8-2.9μm。菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定利用金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa201101菌株的菌丝体提取总DNA，然后以所提取的DNA为模板，以真菌ITS区通用引物ITS-4和ITS-5（由上海生工生物工程股份有限公司合成）进行PCR扩增，2×TaqPCRMasterMix（含染料）12.5µL；引物ITS4/ITS5(10µmol/L)各1µL；ddH2O9.5µL；模板DNA1µL。PCR反应程序：95℃预变性4min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃延伸7min，用无菌水代替模板作阴性对照。PCR产物经过电泳条带检测后确认样品DNA-ITS区域PCR扩增产物符合测序要求后，将PCR扩增产物进行连接、转化之后，送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行序列测定。将测序结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。扩增引物序列：ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。ITS5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。本专利技术金龟子绿僵菌菌株的ITS的序列如SEQIDNO.3所示，通过NCBI/blast比对后发现与金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）（FJ545320.1）同源性最高，达99.83%，可以确认该菌株为金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）。金龟子绿僵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金龟子绿僵菌，其特征在于：所述菌株为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101，该菌株已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.9780。

【技术特征摘要】
1.一株金龟子绿僵菌在防治油茶象幼虫中的应用，所述菌株为金龟子绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）FJMa201101，该菌株已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNo.9780。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：何学友，蔡守平，杨希，曾丽琼，黄金水，
申请(专利权)人：福建省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：福建;35