本发明专利技术公开了一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌及其构建方法：以转属主粘虫颗粒体病毒（PuGV-Ps）增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌（Bt）为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-1将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因，从而构建稳定表达增效蛋白基因、无抗性标记基因的增效Bt工程菌。本发明专利技术利用增效蛋白基因构建增效基因，在Bt毒蛋白（ICPs）正常使用浓度下，通过增效蛋白的协同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，从而增强防效，产品毒力强、杀虫谱宽、杀虫速度快，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。
Bacillus thuringiensis engineering bacterium with chromosome recombination synergistic protein gene and construction method thereof
The invention discloses a chromosome recombination efficiency gene of Bacillus thuringiensis engineering strain and its construction method: to transfer to the main granulosis virus (PuGV-Ps) enhancin gene, Bacillus thuringiensis (Bt) receptor for bacteria by derivative vector pLTV-1 containing transposon PuGV-Ps enhancin gene integrated into Bacillus thuringiensis thuringiensis chromosome, and after high temperature transfer eliminate resistance marker gene transposition unit, so as to construct the stable expression of Bt protein gene engineering bacteria synergistic efficiency, without resistance marker gene. The invention constructs a synergistic gene by enhancing protein gene, the Bt protein (ICPs) concentration under normal use, improve the activity of Bt protein through the synergistic effect of synergistic protein, thereby enhancing the control effect, the product has high toxicity, wide pesticidal spectrum, insecticidal speed, can not only reduce pesticide residues and improve the quality of agricultural products. And it is an effective way to protect the environment and promote the sustainable development of agriculture.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种染色体重组增效蛋白基因(Enhancin)苏云金杆菌工程菌的构建方法，尤其是一种以转属主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌(Bt)为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-Ι将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因，从而构建稳定表达增效蛋白基因、无抗性标记基因的增效Bt工程菌的方法。
技术介绍
长期以来，农业病虫害的危害主要依赖化学农药防治。我国农田化学农药有效含量年用量超过250000吨，致使农产品农药残留增加、害虫危害加重、生态环境破坏。推广应用生物农药，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。苏云金杆菌(feci77w5.Bt)是研究、应用范围最广的生物杀虫剂，其主要作用成分为具体代谢产生的杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)或δ -内毒素(delta-endotoxin)。ICPs对多种重要的农林业害虫具毒杀作用，Bt已作为有效的微生物农药广泛应用于害虫的生物防治。然而受本身生物学特性的限制，在实际使用中存在毒力不强、杀虫谱窄、杀虫速度慢等影响大面积推广应用的问题，同时害虫对苏云金杆菌抗药性的产生和发展也越来越受到人们的关注，因此构建广谱、高效Bt杀虫工程菌成为苏云金杆菌杀虫剂研究与开发的新方向。增效蛋白(Enhancin)最早是在粘虫颗粒体病^iPseudaletiaunip皿ctagranulovirus, PuGV)包涵体中发现的能提高核型多角体病毒侵染能力的生物增效因子，目前已在PuGV、粉纹夜蛾颗粒体病毒(rricAoWttsia ni GV，TnGV)、棉铃虫颗粒体病毒{Helicoverpa armigera, HaGV)等8种颗粒体病毒、4种痘病毒、2种多角体病毒中发现这类增效作用的蛋白存在 。增效蛋白对Bt毒力同样具有显著增强作用。将TnGV包涵体中纯化的增效蛋白加入Bt后饲喂试虫，测试的6种不同鳞翅目幼虫的死亡率提高了 2-10倍；4种不同的Bt商品制剂中加入TnGV增效蛋白对粉纹夜蛾的防效提高了 3-6倍。江苏里下河地区农科所自2000年开展转属主颗粒体病毒PuGV-Ps对Bt增强作用研究，证明PuGV-Ps中含有提高Bt毒力的增效蛋白，微量PuGV-Ps对Bt增效作用显著，同时可提高Bt对害虫的作用速度。颗粒体病毒增效蛋白的杀虫增效活性，在杆状病毒、苏云金杆菌等微生物农药的研究应用上具有广阔的前景。目前构建Bt工程菌的主要途径是通过增加ICPs基因拷贝数、消除冗余质粒、辅助蛋白利用等手段提高ICPs基因的表达量。这种改造虽提高了 Bt工程菌的杀虫活性，但某种意义上讲是通过提高ICPs使用浓度而提高防效，同样也存在由于增加ICPs选择压力带来的害虫抗药性风险
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，本专利技术利用增效蛋白基因构建增效基因，在ICPs正常使用浓度下，通过增效蛋白的协同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，从而增强防效，产品毒力强、杀虫谱宽、杀虫速度快，不仅可以降低农药残留、提高农产品品质，而且更是保护环境、促进农业可持续发展的有效途径。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌，所述工程菌是以转属主粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌(Bt)为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV-Ι将PuGV-Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因获得。上述染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌的构建方法: (1)PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆:室内人工饲养东方粘虫，以PuGV感染寄主，分离纯化获得PuGV-Ps，提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En ;扩增基因En与克隆载体pET-15b经酶切连接并转化大肠杆菌DH5 α，氨苄青霉素LB平板筛选克隆子，酶切鉴定重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En ； (2)增效蛋白整合载体的构建:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，扩增增效蛋白基因；以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化连接扩增的增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子ToplO-3, Xhol和Nhel双酶切鉴定增效蛋白基因的插入位点和方向，获得增效蛋白基因整合载体pLTVl-En ； (3)苏云金杆菌感受态细胞的制备及整合载体的转化:LB液体培养基接种苏云金杆菌活化，以LB+0.5M山梨醇为培养基转接培养制备苏云金杆菌感受态细胞；ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合载体pL TVl-En，电击法将整合载体pLTVl-En转化至苏云金杆菌感受态细胞，氨苄青霉素LB平板筛选阳性克隆子，获得转化子Bt-En-1 ； (4)转化子的高温转接和筛选:将转化子Bt-En-1接种于LB培养液中，40_50°C培养并转接5-7次后涂氨苄青霉素LB平板产生单菌落，分别点种在氨苄青霉素单抗平板和无抗平板的对应位置，置28-30°C培养48h后，挑选无抗培养基中失去抗性的单菌落，显微镜镜检是否产生伴胞晶体蛋白，再通过提取质粒和PCR扩增，最后得到染色体重组增效蛋白苏云金杆菌工程菌Bt-En。步骤(I)中所述提取颗粒体病毒DNA，PCR扩增增强蛋白全长基因En的方法为:碱裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，设计上游引物:5’_ GC CAT ATG TCG TAC AAAGTG ATT GTA CCC GC T-3，，下游引物:5’ - GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TATCAT T -3’，引入!,Xho I两个酶切位点，PCR扩增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR扩增的反应条件:先94°C预变性4min，然后依次94°C变性30sec、56°C复性30sec、72°C延伸3min，30个循环；最后72°C延伸IOmin ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。步骤(2)中所述以重组增效蛋白基因质粒pET-15b_En为模板，扩增增效蛋白基因为:以重组增效蛋白基因质粒pET-15b-En为模板，设计上游引物:5’_AG AAT TCG AGC TCGGTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGGATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入酶切位点，PCR 扩增增效蛋白基因，PCR扩增反应条件:先95°C预变性5 min，然后依次97°C变性30sec、55°C复性30sec、72°C延伸3min，35个循环；最后72°C延伸10 min ;琼脂糖电泳检测扩增增效蛋白基因片段。步骤(2)中所述以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，Saml酶切线性化连接增效蛋白基因后转化大肠杆菌感受态细胞ToplO的方法为:以含有转座子Tn917的衍生质粒pLTVl为载体，5.湖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种染色体重组增效蛋白基因苏云金杆菌工程菌，其特征是，所述工程菌是以转属主粘虫颗粒体病毒PuGV?Ps增效蛋白基因为目的基因、苏云金杆菌Bt为受体菌，通过含转座子的衍生载体pLTV1将PuGV?Ps增效蛋白基因整合到苏云金杆菌染色体上，并经过高温转接消除转座单元外的抗性标记基因获得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐健，韩光杰，赵松，刘琴，李传明，马谈斌，
申请(专利权)人：江苏里下河地区农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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