尼可霉素X组分高产工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于抗生素基因工程领域。具体地讲涉及从一株圈卷产色链霉菌７１００（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｓｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＣＧＭＣＣ４．３２１克隆了尼可霉素生物合成基因ｓａｎＵ，把ｓａｎＵ基因与黑色素生物合成结构基因的启动子（Ｐｍｅｌ）连接，之后克隆在单拷贝整合型质粒ｐＳＥＴ１５２的多克隆位点上，然后转化野生型圈卷产色链霉菌７１００　　ＣＧＭＣＣ　　４．３２１原生质体，得到的重组工程菌的尼可霉素Ｘ组分产量比野生型菌株高２倍左右。该高产工程菌可在制备抗生素药物中应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗生素基因工程领域。具体地讲涉及从一株圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)CGMCC 4.321克隆了尼可霉素生物合成基因sanU，使sanU基因与黒色素生物合成结构基因的启动子(Pmel)连接，之后克隆在单拷贝整合型质粒pSET152的多克隆位点上，然后转化野生型圈卷产色链霉菌CGMCC 4.321原生质体，得到的重组工程菌的尼可霉素X组分产量比野生型菌株高2倍左右。该高产工程菌可在制备抗生素药物中应用。
技术介绍
圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)CGMCC 4.321是从我国东北土壤中分离到的尼可霉素产生菌。尼可霉素是一类核苷肽类抗生素，因其结构与几丁质合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺相类似，竟争性抑制几丁质合成，从而具有杀真菌、昆虫、螨虫的效果。又因其在自然界中易分解及对哺乳动物、植物低毒或无毒，故是一种理想的农用和医用抗生素。尼可霉素生物合成途径尚未研究清楚。现有研究表明，在圈卷产色链霉菌(CGMCC 4.321)中，有近30个基因参与尼可霉素的生物合成。对这些基因的研究不仅有助于弄清尼可霉素生物合成途径，而且可能获得高产和定向组分的工程菌，为下一步尼可霉素组合生物学研究奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株通过基因工程改造的高产尼可霉素X组分的圈卷产色链霉菌(CGMCC 4.321)以及构建该重组工程菌的方法。利用本专利技术的工程菌可使尼可霉素X组分产量比野生菌株高2倍左右。本专利技术所使用的圈卷产色链霉菌是由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)提供的，其原保藏号为CGMCC 4.321。本专利技术的另外一个目的是提供一种使圈卷产色链霉菌高产尼可霉素X组分的如SEQ ID No.1(或附图说明图1)所示的sanU基因；和一种含有该基因所构建的尼可霉素X组分高产工程菌重组质粒；并由该重组质粒转化野生型圈卷产色链霉菌(CGMCC 4.321)原生质体获得重组工程菌。本专利技术的最终目的还在于使该高产工程菌在制备抗生素药物中的应用，以显示本专利技术获得的显著进步。为了达到本专利技术的上述目的，涉及如下技术步骤(1)利用包括部分sanO基因序列的1.35kb BamHI-ApaI片段(聂丽平，张集慧，谭华荣，微生物学报，41(1)59-64，2001)为探针，从圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)的cosmid文库中克隆到10.6kbPstI片段。(2)绘制该10.6kb PstI片段的物理图谱，对此片段进行亚克隆、序、拼接。(3)用软件FramePlot2.3.1对所测序列进行开放阅读框分析，找到一个468bp的开放阅读框，命名为sanU基因。(4)采取基因阻断的方法对sanU基因的功能进行研究。把能在链霉菌中表达的卡那霉素抗性基因通过合适的酶切位点连接在sanU基因内部，而后克隆到温度敏感型穿梭质粒pKC1139，构建用于阻断sanU基因的重组质粒。(5)把上述重组质粒通过原生质体转化的方法导入圈卷产色链霉菌中，经温敏试验、抗性筛选、Southern杂交验证后，选择正确的sanU基因破坏菌株进行发酵，发酵液经HPLC测定发现，sanU基因破坏菌株的尼可霉素产量大大降低。说明sanU基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成的重要基因。(6)构建尼可霉素X组分高产工程菌。把sanU基因连接到黒色素生物合成结构基因的启动子(Pmel)下，然后克隆在单拷贝整合型质粒pSET152的多克隆位点上，转化野生型圈卷产色链霉菌原生质体，经抗性筛选、Southern杂交验证，选择正确的工程菌进行发酵，发酵液经HPLC分析。发现工程菌的尼可霉素X组分产量比野生菌株高2倍左右。(7)抑菌试验表明，尼可霉素X组分高产工程菌具有更强的抑菌能力。以上所述技术步骤，是本
的普通专业技术人员都能理解和实现的。为了便于理解本专利技术，通过附图予以进一步说明。图1sanU基因的核苷酸序列图2根据sanU基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列图3用于阻断sanU基因的重组质粒构建示意4用于构建尼可霉素X组分高产工程菌重组质粒示意5尼可霉素X组分高产工程菌发酵产物HPLC分析(A为野生菌株，B为尼可霉素X组分高产工程菌)图6尼可霉素X组分高产工程菌发酵产物对烟草赤星灰霉的抑制作用(中间为野生菌株，周围为尼可霉素高产工程菌)具体实施方案通过以下实施列，对本专利技术做进一步说明。实施列1圈卷产色链霉菌(CGMCC 4.321)sanU基因的克隆及其功能和尼可霉素X组分高产工程菌的构建(1)sanU基因的克隆A、圈卷产色链霉菌(CGMCC 4.321)基因组文库中的cosmid1、2、3经PstI酶切后，和包括部分sanO基因序列的1.35kb BamHI-ApaI片段(聂丽平，张集慧，谭华荣，微生物学报，41(1)59-64，2001)进行杂交，根据阳性信号回收cosmid3中10.6kb PstI片段，然后克隆在质粒M13-的PstI位点。B、利用不同的限制性内切酶对10.6kb PstI片段进行酶切，选择合适的酶绘制酶切图谱。并进行亚克隆、测序、拼接，用软件FramePlot2.3.1对所测序列进行开放阅读框分析，找到一个468bp开放阅读框如SEQ IDNo.1以及图1所示，其推测的氨基酸序列和谷氨酸变位酶的S亚基具有23％的一致性。(2)sanU基因的阻断A、用限制性内切酶XhoI把含sanU基因的1.3kb片段从重组质粒pLY001切下，然后克隆在M13-的XhoI上，得重组质粒pLY002。利用M13-多克隆位点上的HindIII/KpnI位点把含sanU基因片段克隆到pUC18的相同位点上，得重组质粒pLY003。BamHI/KpnI卡那霉素抗性基因片段经Klenow酶补平后连接在上述重组质粒sanU基因内部经补平的BamHI位点，得重组质粒pLY004。以HindIII/EcoRI从重组质粒pLY004切下外源片段，克隆到温度敏感型穿梭质粒pKC1139，构建成用以阻断sanU基因的重组质粒pLY101如图3所示。B、质粒pLY101转化E.coli ET12567感受态细胞，再从中提取质粒pLY101，而后转化圈卷产色链霉菌(CGMCC 4.321)原生质体，利用阿普霉素筛选转化子，转化子在基本培养基上培养产孢子，收集孢子，42℃条件下进行温敏试验。质粒pKC1139在42℃不能自主复制，因此，在42℃条件下，只有质粒pLY101上sanU基因及其两侧序列和圈卷产色链霉菌(CGMCC 4.321)染色体相应序列发生同源交换的菌株才能在含卡那霉素的平板上生长。利用阿普霉素来选择发生同源双交换的菌株，在含卡那霉素的平板上能生长而在含阿普霉素的平板上不能生长的菌株可能为发生双交换的sanU基因阻断突变株。C、提取sanU基因阻断突变株的总DNA及野生菌株的总DNA，以XhoI酶切，地高辛标记的含sanU基因的XhoI片段为探针。杂交后野生菌株出现1.2kb左右杂交带，阻断突变株在2.2kb处有杂交带。(3)尼可霉素X组分高产工程菌的构建A、黒色素生物合成结构基因的启动子(Pmel)片段被克隆在p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产尼可霉素Ｘ组分的圈卷产色链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｓｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（ＣＧＭＣＣ　　４．３２１）重组工程菌，其特征是由含ｓａｎＵ基因的质粒转化野生型圈卷产色链霉菌（ＣＧＭＣＣ　　４．３２１）原生质体，得到的一种圈卷产色链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｓｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）（ＣＧＭＣＣ　　４．３２１）重组工程菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谭华荣，李毅荣，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]