一种高转化效率的大肠杆菌表达菌株制造技术

本发明专利技术涉及一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株CGMCCNo.7123。该菌株是将大肠杆菌异源蛋白表达菌株BL21(DE3)基因组中编码I型限制性内切酶的hsdR基因通过重组工程法敲除后而获得。hsdR基因敲除后不携带任何外源碱基序列。该菌株的转化效率是BL21(DE3)原株的14.5倍。CGMCCNo.7123可成为通用的异源蛋白表达菌株以及直接用于筛选表达突变体库蛋白的菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体是涉及一种高转化效率的大肠杆菌表达菌株。
技术介绍
酶是工业化生产的关键材料，也是现代绿色经济和工业生物技术的基础。野生型的酶常常难以具有人们所期望的最佳活性。高催化活性以及高催化专一性的酶的获得常常依赖于基因突变，由于突变的随机性，目标突变只占最终突变的极小比例，一般在百万分之一的级别，因此高转化效率的菌株是获得高覆盖率的蛋白突变体库的基础之一。突变体库也是研究基因或蛋白的结构和功能的关键手段。常规的得到蛋白突变体的实验步骤是将通过特定方法(如DNA shuffling和易错PCR)所获得的突变体基因库以限制性内切酶进行酶切后所得的DNA片段和同样酶切的载体在T4连接酶的作用下相连，连接液转化至克隆宿主菌大肠杆菌如DHlOB或JM109，培养所得抗性菌株，从中提取质粒后，再转化至异源异源蛋白表达宿主菌。其中大肠杆菌BL2KDE3)是最为常用的宿主菌，其他的菌株一般为此菌株的衍生菌株。采用提取质粒再转化BL21(DE3)的两步法而非直接转化BL21(DE3)的原因在于后者的转化效率较低，一般低十倍以上。低效率使得获得目的突变的几率大大降低而不被采用。两步转化法不仅增加了实验步骤，更为关键的是造成了一定量的(也可能是非常关键的)突变体库的损失。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株，该菌株是将大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)基因组中的hsdR基因敲除而获得。本专利技术所述的大肠杆菌表达菌株，是埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCCN0.7123或其变异体。埃希氏大肠杆菌CGMCC N0.7123是通过以下方法获得:首先将hsdR基因上下游各500bp的同源片段以及两侧含有18bp 1-SceI酶切位点的氯霉素抗性基因通过重叠延伸PCR融合在一起，此线性融合片段还包含下游500bp的同源片段之后的50bp的序列。将此线性融合片段电转化至表达重组酶的BL21 (DE3)，由重组酶催化同源片段之间的同源重组而将线性融合片段取代BL21(DE3)基因组上的hsdR基因部分，hsdR基因被敲除。随后经诱导表达的1-SceI作用于所得菌株基因组中的1-SceI酶切位点，引起基因组双链的断裂。此时菌株利用自身的同源重组系统如recA和recBCD催化线性整合片段和500bp的同源片段下游的两个50bp片段之间发生同源重组，即将两个片段之间的序列以及其中的一个片段去除，经过此步骤，修复了基因组双链的断裂，菌株恢复生长。最终得到hsdR基因敲除、且不含有任何的外源碱基序列的基因工程菌株。重组工程的基本原理是利用重组酶催化同源片段之间发生重组，而将基因组上的基因进行敲除。由于可以直接采用PCR扩增的中间含有抗性基因的线性同源片段(而无需将片段克隆至载体)进行转化，因此重组工程方法高效简便和快捷。本专利申请所使用的重组酶基因是指来源于λ噬菌体的red a，red^和red Y基因，重组酶基因是由IPTG诱导的受LacI基因所调节pLac启动子所驱动；1-SceI基因是由L-阿拉伯糖诱导的受araC基因所调节的PBAD启动子所驱动。LacI基因和araC基因的调节系统均为严谨调节系统，即不加诱导剂时，启动子下游的基因几乎不表达，这就保证了重组酶表达的严格时空性，不会过量表达而引起异常重组。BL21(DE3)基因组上不含有1-SceI酶切位点，故以1-SceI酶切可表现出良好的专一性。hsdR基因编码I型限制性内切酶，其功能可能是降解外源DNA。本专利将之敲除发现hsdR基因敲除变株较原株BL21 (DE3)转化效率提高14.5倍，达到4.5χ107/ μ g，原理上任何突变体可通过此高转化效率的菌株获得。从变株中提取的质粒酶切和蛋白表达实验确证了菌株的高转化效率，也证明了质粒在其中的正确复制和表达。高转化效率突变株将减少一个实验步骤，有利于简便快捷地获得突变体蛋白库。所获的菌株埃希氏大肠杆菌CGMCC N0.7123菌株的优点在于:转化效率较原株高14.5倍，不仅可以作为常规的蛋白表达菌株来使用，其优点在于可直接将连接液转化至此菌株来筛选重组克隆。而更显著的优点是可以将突变的基因库和载体的连接液转化至此菌株，来筛选得到突变体蛋白库。高转化效率的蛋白表达菌株将在蛋白质工程等研究领域有着重要的应用，如连接产物的转化效率一般为质粒的1/100，此时十余倍的转化效率将有助于获得更多的转化克隆，即覆盖更多的突变体，有利于迅速地筛选得到目的突变。作为获得高催化效率的催化用酶等工业化研究中的一个关键材料，本高转化效率的菌株将有着广泛的应用空间，也可能获得良好的经济效益。附图说明图1是BL21(DE3)基因组中hsdR基因敲除实验各菌株基因型验证的凝胶电泳结果O1.A-EcoT14- 1 DNA 分子量标准:10329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp,74bp ；2.BL21 (DE3)原株以R1742和R1736为引物进行菌落PCR的结果，得到4330bp的片段；3.BL21 (DE3)的氯霉素抗性基因取代hsdR基因所得变株LS1926以R1742-R1736为引物进行菌落PCR的结果，得到2500bp的片段；4.氯霉素抗性基因去除的、hsdR基因敲除的变株LS1928(基因型:BL21(DE3)AhsdR)以R1742-R1736为引物进行菌落PCR的结果，得到822bp的片段；5.DL2000DNA 分子量:2.0, 1.0, 0.75，0.5，0.25，0.lkb。图2是各菌株中所提取的pLS1942质粒DNA酶切验证结果。1.从 DHlOB 中提取的 pLS1942 以 NcoI 和 XhoI 双酶切，得到 1.0kb 和 5.4kb ；2和3.从BL21 (DE3)中提取的pLS1942以NcoI和XhoI双酶切，得到1.0kb和5.4kb ；4.λ -EcoT14-1 DNA 分子量标准:10329bp，7743bp，6223bp，4254bp，3472bp，2690bp,1882bp,1489bp,925bp,421bp,74bp ；5.DL2000DNA 分子量标准:2.0，1.0，0.75，0.5，0.25，0.1kb ；6和7.从LS1928中提取的pLS1942以NcoI和XhoI双酶切，得到1.0kb和5.4kb。图3是BL21 (DE3)和LS1928两个菌株蛋白表达的结果。I 和 3.BL21 (DE3)/pLS1942 表达的总蛋白；2和4.BL21 (DE3)/pLS1942表达的可溶性蛋白；5.蛋白质分子量标准:116，66，45，35，25，18，14KDa ;6 和 8.LS1928/pLS1942 表达的总蛋白；7和9.LS1928/pLS1942表达的可溶性蛋白。具体实施例方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株，其特征在于，是将大肠杆菌异源蛋白表达菌株BL21(DE3)基因组中编码I型限制性内切酶的hsdR基因通过重组工程法敲除后而获得。

【技术特征摘要】
1.一株高转化效率的大肠杆菌表达菌株，其特征在于，是将大肠杆菌异源蛋白表达菌株BL21 (DE3)基因组中编码I型限制性内切酶的hsdR基因通过重组工程法敲除后而获得。2.如权利要求1所述的大肠杆菌表达菌株，是大肠埃希氏菌(Escherchiacoli)CGMCCN0.7123。3.权利要求1所述高转化效率的大肠杆菌表达菌株的构建方法，是指通过重组酶催化PCR所获得的线性片段和基因组上的...

【专利技术属性】
技术研发人员：尚广东，石牡丹，王瑞青，李玲，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：