本发明专利技术公布一种结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白及其应用。本发明专利技术提供了一种结核分枝杆菌ESAT6密码子优化方法、串联重组融合方法及融合蛋白制备方法，还提供了该重组融合蛋白在全血IFN-γ结核诊断试剂盒及TCELL-SPOT结核感染诊断试剂盒的制作和应用方法，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了结核(TB)感染临床诊断的需要。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域及医学免疫学领域，涉及结核病病人和结核杆菌感染者的快速、早期特异的检测方法，具体的涉及一种结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白及其应用，特别是一种结核病抗原ESAT6串联重组融合蛋白特异的全血IFN-Y结核诊断试剂盒及TCELL-SP0T结核感染诊断试剂盒的制作方法和应用方法。
技术介绍
结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染所致的人类疾病，主要通过呼吸道传播，且疫情发展日趋严重。结核病的预防、早期诊断和及时治疗意义重大。MTB标准菌株H37Rv被广泛应用于TB相关的生物医药研究，其特异性抗原的制备备受关注。目前常用的结核特异抗原可以通过基因工程方法大量制备，是结核诊断的基础。但是目前多集中于单独一种抗原的表达、单独抗原表位的表达、多种抗原联合表达的方法获得结核特异抗原，少有单一抗原串联重组表达的研究，且结核特异性抗原多直接用血清学方法检测结核感染，灵敏度低、特异性差。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种用基因工程方法生产的结核ESAT6串联重组融合蛋白作为抗原，特异性强且易于纯化，用其作为特异抗原制备了全血IFN- Y结核诊断试剂盒及TCELL-SP0T结核感染诊断试剂盒，为结核病感染的检测提供更为特异、灵敏、准确的工具。一种编码结核分枝杆菌ESAT6基因的密码子优化基因序列，其单拷贝核昔酸序列如SEQ ID N0.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示，ESAT6基因串联次数包括但不限于1-6次。结核分枝杆菌 ESAT6串联重组融合蛋白，它由上述的密码子优化基因序列编码，其单拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示，5次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示，ESAT6蛋白串联次数包括但不限于1-6次。结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的表达载体，它是将上述的密码子优化基因序列分别插入到质粒pET-25b上，得到重组质粒ESAT6cl-pET25b、ESAT6c2_pET25b、ESAT6c3-pET25b、ESAT6c4_pET25b、ESAT6c5_pET25b 或 ESAT6c6_pET25b，载体包括但不限于pET25b。—种表达结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的工程菌株,它含有上述的表达载体，其宿主菌为大肠杆菌{Escherichia coif)。一种基于所述结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的化学发光法试剂盒，其利用上述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血释放Y-干扰素，并通过化学发光的方法测定Y-干扰素的变化，诊断是否感染结核分枝杆菌。一种基于所述结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白建立的体外检测结核杆菌感染的TCELL-SP0T试剂盒，其利用上述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，刺激受检者的外周血T淋巴细胞，并通过ELISPOT的方法测定斑点形成的多少，诊断是否感染结核分枝杆菌。所述的结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片中的应用。附图说明图1重组质粒ESAT6cl-pET16b的构建示意图； 图2重组质粒ESAT6c2-pET16b的构建示意图； 图3重组质粒ESAT6c3-pET16b的构建示意图； 图4重组质粒ESAT6c4-pET16b的构建示意图； 图5重组质粒ESAT6c5-pET16b的构建示意图； 图6重组质粒ESAT6c6-pET16b的构建示意图； 图7 ESAT6cl重组融合蛋白纯化图，图中泳道1: NEB蛋白Marker ;泳道2，3，4，5, 6, 7:ESAT6cl纯化带；泳道8:ESAT6cl纯化后；泳道9:ESAT6cl纯化前； 图8 ESAT6c2重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c2纯化前；泳道3:ESAT6c2纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6cl纯化带； 图9 ESAT6c3重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c3纯化前；泳道3:ESAT6c3纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6c3纯化带； 图10 ESAT6c4重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c4纯化前；泳道3:ESAT6c4纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6c4纯化带； 图11 ESAT6c5重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2:ESAT6c5纯化前；泳道3:ESAT6c5纯化后；泳道4，5，6，7:ESAT6c5纯化带； 图12 ESAT6c6重组融合蛋白纯化图，图中泳道1:NEB蛋白Marker ;泳道2，3，4, 5, 6:ESAT6c6纯化带；泳道7:ESAT6c6纯化前；泳道8:ESAT6c6纯化后； 图13 TCELL-SP0T检测结果图，图中a为结核感染者阳性对照孔；b为结核感染者ESAT6cl检测孔；c为结核感染者ESAT6c2检测孔；d为结核感染者ESAT6c3检测孔；e为结核感染者ESAT6c4检测孔；f为结核感染者ESAT6c5检测孔；g为结核感染者ESAT6c6检测孔；h为结核感染者阴性对照孔。具体实施方式 以下以通过优选实施例对本专利技术工艺作进一步的详细说明，但本专利技术的保护范围并不局限于此。具体实施方式下面对本专利技术进一步说明。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的保护范围。实施例1结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的制备 分析编码结核特异性抗原ESAT6的核苷酸序列，并结合疋coli的密码子偏好性，对ESAT6的核苷酸进行同义密码子的优化，并在其编码序列的两端加入设计好的限制性酶切位点，从而实现序列的串联表达。经过优化的核苷酸序列如下: catatgggaattcccatggaggatccgatgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgctgcaagcgcaatccagggtaatgtcacgtccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctgaacaacgcgttgcagaacctggcgcgtacgatcagcgaagccggtcaggcaatggcttcgaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcagcagatctggctaagcttcccgggtcga本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码结核分枝杆菌ESAT6基因的密码子优化基因序列，其特征在于：其单拷贝核昔酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示，ESAT6基因串联次数包括但不限于1?6次。
【技术特征摘要】
2012.07.20 CN 201210254850.51.一种编码结核分枝杆菌ESAT6基因的密码子优化基因序列，其特征在于:其单拷贝核昔酸序列如SEQ ID N0.1所示，2次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，3次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，4次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，5次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示，6次拷贝串联核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示，ESAT6基因串联次数包括但不限于1-6次。2.结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白，其特征在于:它由权利要求1所述的密码子优化基因序列编码，其单拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，2次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，3次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，4次拷贝氨基酸序列如SEQID N0.10所示，5次拷贝氨基酸序列如SEQ ID N0.11所示，6次拷贝氨基酸序列如SEQ IDN0.12所示，ESAT6蛋白串联次数包括但不限于1_6次。3.结核分枝杆菌ESAT6串联重组融合蛋白的表达载体，其特征在于:它是将权利要求1所述的密码子优化基因序列分别插入到质粒pE...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨艳坤，白仲虎，刘晓磊，李昕，朱国珍，林兴兵，曹成，付建军，
申请(专利权)人：郑州博赛生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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