本发明专利技术公开了Harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用。本发明专利技术所获得harpinZPsgS1蛋白处理烟草，可以促进烟草的生长，显著提高烟草对烟草花叶病毒、烟草疫霉病的抗性，而且该抗性不仅局限于harpinZPsgS1处理的部位，也包括处理周边的叶片及整株植物，并且该过程伴随着PR蛋白的表达，说明harpinZPsgS1可以诱导植物系统获得抗病性，以上结论证明harpinZPsgS1具有开发成生物源农药的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程领域，涉及Harpin编码基因或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用。
技术介绍
大豆细菌性斑点病是我国尤为北方大豆产区的一种主要病害，给农业生产带来巨大损失，其致病菌丁香假单胞菌大豆致病变种syringae pv.glycinea)包是世界范围内重要的植物病原细菌。同其他革兰氏阴性植物病原细菌一样，Pseudomonassyringae pv.glycinea拥有保守的Ar/ 基因簇,决定着病原菌在非寄主植物和抗病植物上的过敏反应(hypersensitive response, HR)和在感病寄主上致病性(pathogenicity)。Ar/7基因簇的特定基因编码产物harpins是一类非特异性蛋白质激发子，该蛋白质富含甘氨酸，不含半胱氨酸，对热稳定，对蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制，是目前研究得较为深入的一类细菌分泌蛋白。Wei (1992)首次从梨火疫(万.中分离得到一种能引起过敏反应的蛋白激发子HrpN，随后harpin在所有常见的革兰氏阴性植物病原细菌中得到了鉴定。国外已从A syringae 5个致病变种中克隆出相应的Ar/ 基因，并证实其活性，但国内对来源于丁香假单胞菌0°.syring￡w)饱hrp基因方面的研究较少,不同菌株编码的harpin蛋白的活性和功能也不尽相同，并且体外高效表达纯化的harpin蛋白用于指导生物防治还没有得到广泛的应用。因此，harpin蛋白作为新型微生物蛋白农药的代表具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白的应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现:harpin编码基因或其表达的harpinZPsgS1蛋白在促进烟草的生长,提高烟草抗病性中的应用，其中，所述的harpin编码基因hrPZPsgS1的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，harpinZPsgS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白优选在促进烟草的生长，有效提高烟草对烟草花叶病毒病和烟草疫霉病的抗性中的应用。其中，所述的harpinZPsgS1蛋白优选通过如下方法制备: (1)提取大豆细菌性斑 点病菌SI菌株的基因组DNA，根据Genbank中登录号为L41862的ArpZ序列，设计完整开放阅读框引物SEQ ID N0.3/ hrpZPsgS1~V2..SEQ IDN0.4; (2)将_70°C保藏的保藏号为CGMCCN0.6699的大豆细菌性斑点病菌SI菌株在KB固体培养基上28°C条件下培养24小时后转入KB液体培养基，继续震荡培养24h后，收集新鲜的菌液提取基因组DNA，以活化的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应条件:94°C预变性4min，94°C变性 lmin，56°C退火 lmin，72°C延伸 90s，循环 35 次，72°C延伸 IOmin; (3)将PCR产物与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经质粒PCR和酶切验证得到阳性转化子，提取重组质粒DNA并测序； (4)以测序正确的阳性重组质粒PMDlS-T-ArA^w为模板，PCR扩增，扩增产物回收后备BamWl和&0R1双酶切后连接到表达载体pET41a (+)上，使得細ZFsffSJ基因与pET41a (+)上的还原型谷胱甘肽GST标签融合，进而得到重组质粒pET41a(+)~hrpZPsgS1,将重组质粒和pET41a(+)转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR和酶切鉴定出阳性重组菌株； (5)重组菌株在含km50yg /ml的LB液体培养基中，37°C、200rpm/min振荡培养过夜，次日按照1%的比例转接到km50的液体LB中，37°C振荡培养约2-3h，至OD6qq=0.6 0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37°C振荡培养2_3h，取诱导的菌液离心收集菌体，用PH7.4的终浓度为0.1M的PBS磷酸缓冲液润洗三次菌体，重溶于1/20原菌体培养体积的磷酸缓冲液中，向菌体悬浮液中加入终浓度为100 μ g/ml的溶菌酶，终浓度为0.1mM的蛋白酶抑制剂PMSF，经超声波破碎后离心取上清即为粗提蛋白，使用GSTrapFF对标签蛋白进行纯化，具体操作参照说明书进行，得到纯化的harpinZPsgS1蛋白。有益效果 1.本专利技术公开了一种大豆细菌性斑点病SI菌株的基因序列及其所编码的蛋白质，采用基因工程方法利用GST融合表达harpin蛋白，显著提高其在大肠杆菌中的表达量。并通过GSTrap FF对目的蛋白进行纯化,纯蛋白浓度可达1.lmg/ml。2.本专利技术所获得harpinZPsgS1富含甘氨酸，不含半胱氨酸，对热稳定，对蛋白酶K敏感，可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应，并且过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制。3.本专利技术所获得harpinZPsgS1处理烟草，可以促进烟草的生长，显著提高烟草对烟草花叶病毒、烟草疫霉病的抗性，而且该抗性不仅局限于harpinZPsgS1处理的部位，也包括处理周边的叶片及整株植物，并且该过程伴随着PR蛋白的表达，说明harpinZPsgS1可以诱导植物系统获得抗病性，以上结论证明harpinZPsgS1具有开发成生物源农药的应用价值。附图说明图1.重组质粒pET41a (+) ~hrpZPsgS1 CR及酶切验证 A重组质粒ρΕΤ41α(+)-Α^77ΖΛ約的PCR扩增，其中Ml为DNA markerλ -历/ dIII ；M2 为 DNA marker DL2000 ；1 为 pET41 a (+)；2 为 pET41a (+)；B 重组质粒pET41a(+)-Ar/7Z~ 的酶切验证，其中 Ml 为 DNA marker DL2000 ; I 为;2为hrpZPsgS1 ；3为清水对照。图2.harpin ZPsgS1的表达及纯化其中I为大肠杆菌BL21 ；2为BL21/PET-41a(+) ；3为harpinZPsgS1粗提蛋白；4为结合液；5为PBS洗脱一次；6为PBS洗脱二次；7为纯化的harpinZPsgS1蛋白。图3.harpinZPsgS1的生物活性检测其中I为harpinZPsgS1 ；2为清水处理；3为harpinZPsgS1经沸水浴处理IOmin ；4为harpinZPsgS1经蛋白酶K处理；5为harpinZPsgS1与氯化镧混合液；6为harpinZPsgS1与f凡酸钠混合液；7为harpinZPsgS1与环乙酰亚胺混合液。图4.harpinZPsgS1对烟草种子的促生作用 图5.harpinZPsgS1诱导烟草抵抗烟草花叶病毒(TMV)侵染 A烟草花叶病毒病在不同叶片上引起的病变数目示意图；I为清水处理；2为harpinZPsgS1处理叶片之下叶片；3为harpinZPsgS1处理叶片之上叶片，4为harpinZPsgS1处理的叶片； B烟草花叶病毒病在不同叶片上引起的病斑数目统计；a为清水处理；b、c为harpinZPsgS1处理本文档来自技高网...
【技术保护点】
harpin编码基因hrpZPsgS1或其表达的harpinZPsgS1蛋白在促进烟草的生长，提高烟草抗病性中的应用，其中，所述的harpin编码基因hrpZPsgS1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，harpinZPsgS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高学文，张岩，伍辉军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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