本发明专利技术公开了一种抗肌抑素单链抗体及编码基因、表达载体、重组转化子和应用，该抗肌抑素单链抗体包括重链可变区、轻链可变区和连接肽，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。本发明专利技术还提供了所述的抗肌抑素单链抗体的编码基因、表达载体和重组转化子。本发明专利技术还提供了所述的抗肌抑素单链抗体在制备肌肉萎缩药物或动物增重药物中的应用。本发明专利技术抗肌抑素单链抗体可在大肠杆菌中大规模表达生产，成本低，且该抗肌抑素单链抗体分子量小，组织穿透力强，免疫原性低、抗体亲和力强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种抗肌抑素单链抗体及其编码基因、表达载体、重组转化子和应用。
技术介绍
畜禽肉产品是人类主要动物性食品之一。随着人们生活水平的不断提高，消费者对畜禽肉产品的需求日益增加。提高动物产肉性能一直是动物生产研究人员所努力的目标。但目前通过传统的遗传改良和营养调控手段来提高动物生产性能已很难再有大的进展。为了提高动物的生产性能，在饲料中添加各种违禁药物造成食物中毒甚至死亡的事件时有发生，因而研究一种安全、高效、对人类无毒副作用的提高动物生产性能的制剂或产品是目前养殖业所面临的迫切问题。人类骨骼肌萎缩是目前世界上比较常见的肌肉疾病，肌肉萎缩可发生于多种生理、病理条件下，如衰老，恶病质，烧伤，肌肉废弃等，主要表现为肌肉体积的缩小，肌细胞数量的减少，肌细胞内蛋白质含量降低等。动物的产肉性能或人的肌肉发育总是由促进和抑制两类激素或因子联合控制的。如果把免疫学的方法应用于动物或人肌肉发育的调控，选择对肌肉发育有抑制作用的激素或因子作为研究对象，体外制备这些激素或因子的抗体，对动物或人进行被动免疫，从而抑制或减弱该类激素或因子的生理功能，进而提高动物的产肉性能或治疗人类肌肉萎缩。肌抑素(Myostatin，MSTN，GenBank号:ΝΜ_005259.2)又称⑶F_8 (GrowthDifferentiation Factor8,生长分化因子8),属于TGF-β超家族，其仅在骨骼肌中特异表达并分泌至血浆中，是影响骨骼肌生长发育的抑制因子。肌抑素首先以一个376个氨基酸组成的前体非活性形式产生，含有N端的前体肽和C端成熟肽，经两步蛋白酶切后，两个C端亚基通过一个多肽链分子间二硫键形成一个具生物学活性的双亚基成熟肌抑素，同时两个亚基的其余半胱氨酸残基形成经典的半胱氨酸结。成熟肽的氨基酸序列在人类 、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马、鸡和狗间的同源性均是100%。该基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。该基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。该基因天然缺失的比利时蓝牛被称为“双肌牛”。该基因的缺失只影响骨骼肌的发育，对心肌、平滑肌等没有任何影响，不对动物的其它性能产生危害，牛自然状态下的双肌现象证明了这一点。因而肌抑素阻断剂在农业畜禽生产方面具有巨大的应用前景。同时，由于阻断肌抑素信号通路还有望缓解许多疾病伴随的肌肉萎缩症状，因此肌抑素阻断剂同样在肌肉萎缩药物研究方面具有重要的应用前景。目前已经有关于肌抑素结合蛋白或其通路阻断剂的研究，以期用于农业及医药生产。这些肌抑素拮抗剂包括:肌肉抑制剂结合蛋白、外源竞争性可溶肌抑素受体、肌抑素特异性单克隆抗体、肌抑素抗原蛋白、针对肌抑素的RNAi和DNA疫苗等。但上述拮抗剂均存在分子量大、组织穿透性差、免疫原性强等不足之处，在使用多次后会引发动物或人产生特异免疫反应，从而大大限制了其运用。而RNAi和DNA疫苗的稳定性和安全性差，应用效果不理想。通过抗体工程技术来克服上述不足，用完全人源化或者畜禽来源的序列构建单链抗体或单结构域抗体，可以消除潜在的抗免疫球蛋白的特异免疫反应。单链抗体由于其分子量小而具有较强的组织穿透力，免疫原性也比单克隆抗体的大大降低，进而极大地减少了产生抗免疫球蛋白特异免疫反应的可能性。同时由于单链抗体与抗原的结合位点没有改变，其抗体亲和力不会因为分子量降低而变弱。此外，单链抗体还可通过常规基因重组技术在体外工程菌等生物反应器大量获得，与单克隆抗体生产相比大大降低了成本，因此无论在治疗人类肌肉萎缩及提高动物生产性能方面均具有很好的应用前景。目前关于单链抗体的研究主要是针对细菌或病毒的抗原，通过制备相应的单链抗体来中和这些致病细菌或病毒。细菌或病毒是原核生物，其表达的膜抗原等结构简单，针对这些抗原的单链抗体的制备也较方便。但高等动物的内源性激素或因子往往是蛋白肽链经过各种折叠及二硫键相连等形成的具高级结构的多维蛋白，如肌抑素单体蛋白必须通过二硫键形成二聚体后才有生物活性。因此目前尚未发现针对内源性激素的单链抗体的相关研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一种抗肌抑素单链抗体，免疫原性低，与肌抑素亲和力强，并可在大肠杆菌中高效表达。一种抗肌抑素单链抗体，包括重链可变区、轻链可变区和连接肽，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。该抗肌抑素单链抗体分子量小，组织穿透力强，免疫原性低、抗体对肌抑素亲和力强。适宜的连接肽可避免影响抗体蛋白的折叠及其水溶性。本专利技术所选用的连接肽为(Gly4Ser)4,氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。本专利技术还提供了编码所述的抗肌抑素单链抗体的基因。该编码抗肌抑素单链抗体的基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，经大肠杆菌喜爱的密码子设计优化得到，适宜在大肠杆菌中表达 ，避免了因大肠杆菌的密码子偏好导致的抗肌抑素单链抗体翻译效率和表达水平低的问题。本专利技术还提供了包含所述的抗肌抑素单链抗体的基因的表达载体。构建表达载体时，选用的原始载体可以为pET_30a(+)。本专利技术还提供了包含所述的抗肌抑素单链抗体的基因的重组转化子。本专利技术所述的抗肌抑素单链抗体，由包含所述的抗肌抑素单链抗体的基因的重组转化子在16 18° C，180 220r/min，诱导表达30 38h后得到。采用低温、长时诱导表达的方案进行抗肌抑素单链抗体可溶性诱导表达，这样蛋白产物不会形成包涵体，不需经过蛋白变性复性的过程，可使蛋白保持天然活性。优选的，诱导表达的温度为18°C，转速为200r/min，时间为36h。构建重组转化子，即将重组表达载体转化至宿主菌中。所述的宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。本专利技术还提供了所述的抗肌抑素单链抗体在制备肌肉萎缩药物中的应用。本专利技术还提供了所述的抗肌抑素单链抗体在制备动物增重药物中的应用。MSTN基因的缺失或阻断只影响骨骼肌的发育，对心肌、平滑肌等没有任何影响，不对动物的其它性能产生危害，牛自然状态下的双肌现象证明了这一点。因此，将抗肌抑素单链抗体作为肌抑素拮抗剂，制备动物增重药物，可促进肌肉发育，中和肌抑素对肌肉发育的抑制作用，促进成肌细胞增殖及肌细胞生长分化，增加肌肉产量，提高动物的生产性能。本专利技术抗肌抑素单链抗体为抗人源肌抑素单链抗体，可以用来中和肌抑素对肌肉发育的抑制作用。由于肌抑素成熟肽的氨基酸序列在人类、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马、鸡和狗间的同源性均是100%，因此本专利技术所研制的抗肌抑素单链抗体适用于人类及上述各类动物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为:本专利技术抗肌抑素单链抗体是世界上首例能够中和内源抑制性激素-肌抑素的单链抗体，抗体分子量小，组织穿透力强，免疫原性低、抗体亲和力强。本专利技术抗肌抑素单链抗体可在大肠杆菌中大规模表达生产，成本低。附图说明图1a为RNAstructure software预测的优化前单链抗体序列的mRNA 二级结构；图1b为RNAstructure software预测的优化后单链抗体序列的mRNA 二级结构；图1c为Vienna RNA web server software预测的优化前单链抗体序列的mRNA二级结构；图1d为Vienna R本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗肌抑素单链抗体，包括重链可变区、轻链可变区和连接肽，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种抗肌抑素单链抗体，包括重链可变区、轻链可变区和连接肽，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。2.如权利要求1所述的抗肌抑素单链抗体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3 所示。3.编码如权利要求1或2所述的抗肌抑素单链抗体的基因。4.包含如权利要求3所述的抗肌抑素单链抗体的基因的表达载体。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，原始载体为pET-30a(+)。6.包含如权...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，吴兵兵，袁陶燕，齐瑞利，何俊，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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