羊独立生长因子1B的多克隆抗体的获取方法技术

本发明专利技术公开了一种羊独立生长因子1B的多克隆抗体的获取方法，利用设计的特异性引物GFI-1将羊独立生长因子1B基因进行PCR扩增，获得它的CDS序列；并通过特异性引物GFI-2来酶切，并构建原核表达载体，获得原核表达载体pET32a-GFI1B；再将原核表达载体pET32a-GFI1B进行目的基因的诱导表达，获得羊独立生长因子1B蛋白；将羊独立生长因子1B蛋白纯化至85%以上；将纯化后的羊独立生长因子1B蛋白免疫到动物上，在最后一次免疫的一周后采全血并分离血清；将血清纯化后，获得目的羊独立生长因子1B基因的多克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物技术，尤其是一种羊独立生长因子IB的多克隆抗体的获取方法。
技术介绍
独立生长因子IB (growth factor independent IB GFI1B)是 GFIl 家族第二个被发现的基因，1933年，Gilks等在大鼠T细胞淋巴瘤的MOMULV的整合位点位点上第一次发现GFII基因，它位于人类基因组的1ρ22染色体。Rodel等于1998年在鼠类和人类基因组发现了 GFIlB基因，位于人类基因组的9q34.13染色体。研究显示其是一种核转录抑制因子，编码329个氨基酸，其中包含有由20个氨基酸组成的N端SNAG区域和有6个羧基端的C2H2样锌指区域。GFllB的两个区域之间的部分由144个氨基酸组成FIlB主要表达于胎儿和成年人的红细胞系以及巨核细胞系。GFIIB基因在人类红细胞生成和分化过程中起了很重要的作用。黔北麻羊是贵州省三大优良山羊品种之一。其历史悠久，发祥较早，适应能力强，耐粗饲，繁殖率高，产肉性能良好，膻味轻，肉鲜美可口，板皮品质优良等优点为当地群众所喜养。罗卫星等对黔北麻羊的肉用性能和肉质特征进行研究，表明黔北麻羊肉用性能和肉质性质良好，具有很好的开发价值。目前，在GenBank数据中已经能搜索到人、牛、鼠等动物的GFIlB基因的序列，但未见羊的GFIlB基因序列。
技术实现思路
本专利技术的目的是:提供一种羊独立生长因子IB的多克隆抗体的获取方法，它能有效的获得效价高、特异性好的羊独立生长因子IB基因的多克隆抗体。本专利技术是这样实现的:羊独 立生长因子IB的多克隆抗体的获取方法，利用设计的特异性引物GF1-1将羊独立生长因子IB基因进行PCR扩增，获得它的⑶S序列；并通过特异性引物GF1-1来酶切，并构建原核表达载体，获得原核表达载体pET32a- GFIlB ;再将原核表达载体pET32a- GFIlB进行目的基因的诱导表达，获得羊独立生长因子IB蛋白；将羊独立生长因子IB蛋白纯化至85%以上；将纯化后的羊独立生长因子IB蛋白免疫到动物上，在最后一次免疫的一周后采全血并分离血清；将血清纯化后，获得目的羊独立生长因子IB的多克隆抗体；特异性弓I物GF1-1包括上游引物:5 ’ -ATGCCACGCTCCTTCCTGGT-3及下游引物:5’ - TCACTTGAGGTTGTGCTGGCT- 3’ ；特异性引物GF1-2包括上游引物:5’ -GGATCCATGCCACGCTCCTTCCT-3’(下划线为 BamH I 位点);下游引物:5’ -GAATTCTCACTTGAGGTTGTGCTGGC-3’(下划线为 EcoR I 位点)。为了验证本专利技术的效果进行了如下实验: I材料与方法 1.1试验动物 从贵州省习水县采集成年黔北麻羊的脾脏，液氮中保存备用。1.2试剂和载体 RNA提取试剂盒(Trizol)，血液RNA提取试剂盒购自MBI公司；LB培养基；氨苄青霉素(Amp) (100 g/L); 10 X TBE 缓冲液；DEPC 和琼脂糖购自 SIGMA 公司；pMD18_T Vector、反转录试剂盒、Taq酶和dNTP购自大连TaKaRa公司；大肠杆菌TGl、BL21 (DE3)，表达载体pET32a由实验室保存。DL2000 Marker、去离子甲酰胺、引物及其它常用试剂均购自上海生物工程有限公司。1.3总RNA的提取及质量、浓度测定 根据RNA提取试剂盒说明书用Trizol法提取黔北麻羊脾脏总RNA，用血液RNA提取试剂盒提取法提取黔北麻羊血液总RNA。用1%琼脂凝胶糖检测总RNA的完整性，核酸蛋白测定仪测定浓度，-80で保存备用。1.4 GFIlB 基因 cDNA 克隆 根据牛GFIlB基因cDNA序列(NM_001192920)设计特异性引物GF1-1扩增羊GFIlB基因cDNA序列。引物序列如下，上游引物:5 ’ATGCCACGCTCCTTCCTGGT-3，下游引物:5’-TCACTTGAGGTTGTGCTGGCT- 3’。以反转录产物2.5 u L,10XPCR BufferCMg2+ Plus)2 u L,dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 yL，上下游引物各 I y L，Taq 酶(5 U/ML) 0.4 yL，加超纯水至总体积为20 UL0循环程序:95で预变性5 min ；94で变性30 S，55で退火40 S，72 V延伸60 S，35个循环；72で延伸10 min, 4 0C保存，I %琼脂糖凝胶电泳检测。进行目的片段纯化，连接到pmdi8-t载体，转化到大肠杆菌感受态细胞，载体命名为Pmdis-T-GFIib1，测序由北京诺赛公司完成。1.5原核表达载体的构建 采用DNAstar软件对测序正确的序列进行酶切位点分析，并根据原核表达载体pET32a多克隆酶切位点序列设计ー 对带有酶切位点的特异性引物GF1-2。序列如下，上游引物:5’ -GGATCCATGCCACGCTCCTTCCT-3’ (下划线为 BamH I 位点)；下游引物:5’ -GAATTCTCACTTGAGGTTGTGCTGGC-3’(下划线为EcoR I位点)。以PmdIS-T-GFIIB1质粒为模板扩增含酶切位点GFIIB序列。转化pMD18-T载体，进行I和EcoT I双酶切鉴定，将该载体命名为pMD18-T-GFIlB2。对 pMD18_T_GFIlB2 和 pET32a 载体进行 ^atnH I 和 EcoTP I 双酶切，按 DNA胶回收试剂盒说明分别回收目的片段。将2段目的DNA在T4 DNA Ligase作用下于16°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，在37°C培养过夜后挑取阳性克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C振摇过夜，按质粒提取试剂盒提取重组质粒，经酶切和PCR双重鉴定，将阳性克隆测序并命名为pET32a-GFIlB。1.6目的基因的诱导表达 诱导表达參照pET32a原核表达说明书进行。诱导时做GFIlB温度梯度、时间梯度和浓度梯度。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察蛋白质带型。从而确定最佳诱导温度、时间、浓度。1.7 His-GFIlB融合蛋白纯化 将阳性菌液按照1:100比例接种于200ml LB培养基中，添加50ug/mL氨苄青霉素，370C，180rpm/min 扩大培养，培养至 OD6tltl=0.4—0.8 时，加入终浓度为 0.6mM 的 IPTG，30°C，100rpm/min诱导3.5h。随后的蛋白纯化按照Qiagen公司N1-NTA argrose是用说明进行操作，分别收集50uL裂解液上清、沉淀、过柱液、Buffer C和Buffer E洗脱品进行SDS-PAGE分析。纯化后蛋白保存在_80°C冰箱中。1.8 融合蛋白 GFIlB 的 Western Blot 鉴定 纯化后样品经 SDS-PAGE 电泳，250mA 转膜 2h，BSA 封闭，一抗(Rabbit anti HIS Tag,I: 300稀释)37°C孵育1.5h，二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG，1:5000稀释)37°C孵育40本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊独立生长因子1B的多克隆抗体的获取方法，其特征在于：利用设计的特异性引物GFI?1将羊独立生长因子1B基因进行PCR扩增，获得它的CDS序列；并通过特异性引物GFI?2来酶切，并构建原核表达载体，获得原核表达载体pET32a??GFI1B；再将原核表达载体pET32a??GFI1B进行目的基因的诱导表达，获得羊独立生长因子1B蛋白；将羊独立生长因子1B蛋白纯化至85%以上；将纯化后的羊独立生长因子1B蛋白免疫到动物上，在最后一次免疫的一周后采全血并分离血清；将血清纯化后，获得目的羊独立生长因子1B的多克隆抗体；特异性引物GFI?1包括上游引物：5?“?---ATGCCACGCTCCTTCCTGGT?3及下游引物：5“??TCACTTGAGGTTGTGCTGGCT??3’；特异性引物GFI?2包括上游引物：5“?GGATCCATGCCACGCTCCTTCCT?3“；下游引物：5“?GAATTCTCACTTGAGGTTGTGCTGGC?3“?。

【技术特征摘要】
1.种羊独立生长因子IB的多克隆抗体的获取方法，其特征在于:利用设计的特异性引物GF1-1将羊独立生长因子IB基因进行PCR扩增，获得它的⑶S序列；并通过特异性引物GF1-2来酶切，并构建原核表达载体，获得原核表达载体pET32a- GFIlB ;再将原核表达载体pET32a- GFIlB进行目的基因的诱导表达，获得羊独立生长因子IB蛋白；将羊独立生长因子IB蛋白纯化至85%以上；将纯化后的羊独立生长因子IB蛋白免疫到动物上，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈志，罗卫星，刘若余，石照应，陈颖，杨海兵，李世功，龙国荣，宋桃伟，杨永强，蔡惠芬，张依裕，李维静，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：